一种利用IC‑LAMP检测香蕉束顶病毒的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用IC‑LAMP检测香蕉束顶病毒的方法，还包括一组LAMP引物组，所述引物组包含内引物对和外引物对；所述外引物对为BBTV‑F3/BBTV‑B3，序列如SEQ ID NO.1～2所示，内引物对为BBTV‑FIP/BBTV‑BIP，序列如SEQ ID NO.3～4所示。本发明专利技术将血清学和LAMP相结合，首先用特异性的BBTV抗血清捕捉病毒粒子，并以该病毒粒子为模板，利用上述引物组进行LAMP 扩增检测BBTV。该方法是一种简便、灵敏、特异的针对香蕉植株、吸芽及组培苗中BBTV的快速检测技术，操作简单，特异性好，灵敏度高，可应用于BBTV的检测与鉴定，监控其发生、扩散和流行。

A method of using IC LAMP detection of banana bunchy top virus

The invention discloses a method for using IC LAMP detection of banana bunchy top virus, also includes a set of LAMP primer sets, the primer set contains the inner pair and outer primers; the outer primers of BBTV F3/BBTV B3, SEQ ID sequences such as NO.1 ~ 2 as shown in BBTV FIP/BBTV primers BIP, ID sequence of SEQ NO.3 ~ 4 shows. The serological and LAMP combination, first using BBTV antisera to capture virus particles, and the virus particles as a template for LAMP amplification using the primers BBTV group. This method is a simple, sensitive and specific for banana plants, buds and plantlets were BBTV in the rapid detection technology, simple operation, good specificity, high sensitivity, detection and identification can be applied to BBTV, monitoring the occurrence, spread and epidemic.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物病原物检测
，具体地，涉及一种利用免疫捕捉—环介导等温扩增反应（IC-LAMP）检测香蕉束顶病毒（Bananabunchytopvirus,BBTV）的方法。该方法适用于香蕉组培苗和田间香蕉植株上香蕉束顶病毒的快速检测及病害诊断。
技术介绍
香蕉束顶病毒（Bananabunchytopvirus,BBTV）属于矮缩病毒科香蕉束顶病毒属，是香蕉束顶病的病原。BBTV在苗圃和田间仅能由香蕉交脉蚜（Pentalonianigronervosa）以持久性方式传播，其短距离传播主要依赖于蚜虫，而长距离的传播主要来源于带病的繁殖材料；其寄主范围较窄，均属于芭蕉科。香蕉束顶病病株矮缩，新叶变短变窄，呈束状丛生，叶脉上出现深绿色点线状的“青筋”并出现停止生长的现象，少数晚期受害的则果形变细、果味变淡，导致失去商品价值。BBTV的不同株系在不同香蕉品种上症状存在差异。BBTV在香蕉植株中的潜育期一般在25～85d，但也因香蕉品种、气候、非生物因素和BBTV毒株之间的遗传差异而有所不同。香蕉束顶病是世界性限制香蕉生产和分布最严重最普遍的香蕉病害之一，已成为香蕉上重要的毁灭性病害之一，威胁着世界各地的香蕉生产，包括太平洋、印度洋和东南亚。在我国南方的香蕉产区，香蕉束顶病分布较广，特别是在广东，海南、云南和广西等香蕉产区的危害非常严重，发病率严重者达到70%～80%，甚至导致蕉园的毁灭。有效的防治香蕉病毒病主要依靠准确的病毒检测、无毒种苗繁殖、病株移除以及检验检疫等。这些防治措施的基本前提则是灵敏、准确、快速的病毒检测，因此，香蕉束顶病毒的检测对于香蕉束顶病对的防治具有重要的意义。目前，常用的BBTV检测技术是血清学技术和PCR技术。ELISA检测BBTV灵敏度不如PCR，但是PCR需要特殊的仪器设备。环介导等温扩增技术（Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP）是一项核酸扩增新技术。在LAMP反应过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过肉眼观察判定结果。引物设计是否合理是决定LAM方法是否高效、特异的关键。该方法通过4条特异引物，即上游内部引物（FIP）、下游内部引物（BIP）、上游外部引物（F3）、下游外部引物（B3），来识别靶基因的6个特异序列，即位于靶标基因5'端的F1、F2和F3以及3'端的B1c、B2c和B3c区的序列。引物的位置均有严格的顺序性，6个不同位点完全匹配才能进行扩增，具有很高的特异性。通过具有链置换活性的BstDNA聚合酶，使得链置换DNA合成可以不停地自我循环，整个反应分为两大阶段，即初反应物哑铃状模板的合成，基因循环扩增、延伸和再循环阶段。目前，该技术在水产养殖病原物检测、植物病原物检测、医学病原物检测和食品安全检测等领域均有应用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术中香蕉束顶病毒检测方法的缺陷与不足，提供一种利用IC-LAMP检测香蕉束顶病毒的方法。该方法可用于快速、准确地检测香蕉植株、吸芽、香蕉试管苗或组培苗中的BBTV，通过该方法可以检测显症、疑似症状或无症状的香蕉植株或组织中是否含有BBTV，且操作简单，不需要特殊的仪器设备。本专利技术的目的是提供一组用于IC-LAMP法检测香蕉束顶病毒的引物组。本专利技术的另一目的是提供一种利用IC-LAMP检测香蕉束顶病毒的方法。本专利技术的再一目的是提供上述方法在香蕉组培苗和/或田间香蕉植株上对香蕉束顶病毒的快速检测方面的应用。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：一种用于IC-LAMP法检测香蕉束顶病毒的LAMP引物组，所述引物组包含内引物对和外引物对；所述外引物对为BBTV-F3/BBTV-B3，序列如SEQIDNO.1～2所示；所述内引物对为BBTV-FIP/BBTV-BIP，序列如SEQIDNO.3～4所示。引物设计是否合理是决定LAMP方法是否高效、特异的关键。本专利技术设计的LAMP引物组，通过4条特异引物，即上游内部引物（FIP）、下游内部引物（BIP）、上游外部引物（F3）、下游外部引物（B3），来识别靶基因的6个特异序列，即位于靶标基因5'端的F1、F2和F3以及3'端的B1c、B2c和B3C区的序列。引物的位置均有严格的顺序性，6个不同位点完全匹配才能进行扩增，具有很高的特异性。本专利技术所设计得到的上述引物组能够很好的应用于香蕉束顶病毒的LAMP检测。一种利用上述引物以IC-LAMP法检测香蕉束顶病毒的方法，所述方法具体包括如下步骤：S1.用特异性的BBTV抗血清捕捉待测样品中的病毒粒子；S2.以步骤S1捕捉的病毒粒子为模板，利用上述引物组进行LAMP扩增；S3.根据扩增结果判断病毒粒子待测样品中是否含有香蕉束顶病毒；即判断是否捕获到病毒粒子和/或病毒粒子是否为香蕉束顶病毒。其中，优选地，步骤S1所述病毒粒子的捕捉的方法为：将稀释后的BBTV抗血清包被容器（如PCR管）；用碳酸盐包被缓冲液研磨香蕉待检测组织，取适量研磨组织的汁液加入上述容器（如PCR管）中进行孵育，以获得免疫捕捉的病毒粒子。优选地，步骤S1所述BBTV抗血清可以为多克隆抗体或单克隆抗体，可以自制或从商业途径获得。优选地，步骤S2所述LAMP扩增的扩增体系，以扩增体系25μl为例，扩增体系中各组分的含量为：dNTPs（10mmol/Leach）4μL；betaine（5mol/L）5μL；MgSO4（20mmol/L）5μL；10×Thermopolreactionbuffer5μL；引物BBTV-F3/BBTV-B3（25μmol/L）各0.2μL；引物BBTV-FIP/BBTV-BIP（50μmol/L）各0.8μL；Bst酶（8U/μL）1μL；ddH2O补至25μL。优选地，步骤S2所述LAMP扩增的反应条件为：50～65℃恒温水浴中扩增反应60～70min；80～85℃，6～10min。更优选地，步骤S2所述LAMP扩增的反应条件为：60℃恒温水浴中扩增反应65min；85℃，8min。优选地，步骤S3所述根据扩增结果判断病毒粒子是否为香蕉束顶病毒的的具体方法为荧光染料技术或电泳检测技术。优选地，所述荧光染料技术为：取SYBRGreenI荧光染料反应液加入步骤S2所述LAMP扩增的反应产物中，在紫外灯下，若扩增产物为绿荧光色即为阳性反应，表示样品中含有BBTV；若扩增产物颜色不变则为阴性反应，表示样品中不含有BBTV。优选地，SYBRGreenI荧光染料反应液的加入量与反应液的体积比为1：25。优选地，所述电泳检测技术为：将步骤S2所述LAMP扩增的产物进行电泳观察，若扩增产物呈明亮的弥散状核酸泳带，即为阳性反应，表示样品中含有BBTV；若扩增产物无核酸泳带，则为阴性反应，表示样品中不含有BBTV。一种利用IC-LAMP法检测香蕉束顶病毒的试剂盒，包含有上述引物组和/或特异性的BBTV抗血清。进一步优选地，所述试剂盒还包含有LAMP扩增反应所需试剂。优选地，所述试剂盒还包含有如下试剂：溶液1：碳酸盐包被缓冲液（0.05MpH9.6）：称取0.2gNaN3，2.93gN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组用于IC‑LAMP法检测香蕉束顶病毒的LAMP引物组，其特征在于，所述LAMP引物组包含内引物对和外引物对；所述外引物对为BBTV‑F3/BBTV‑B3，序列如SEQ ID NO.1～2所示；所述内引物对为BBTV‑FIP/BBTV‑BIP，序列如SEQ ID NO.3～4所示。

【技术特征摘要】
1.一组用于IC-LAMP法检测香蕉束顶病毒的LAMP引物组，其特征在于，所述LAMP引物组包含内引物对和外引物对；所述外引物对为BBTV-F3/BBTV-B3，序列如SEQIDNO.1～2所示；所述内引物对为BBTV-FIP/BBTV-BIP，序列如SEQIDNO.3～4所示。2.权利要求1所述引物组在香蕉束顶病毒检测中的应用。3.一种利用IC-LAMP检测香蕉束顶病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.用特异性的BBTV抗血清捕捉待测样品中的病毒粒子；S2.以步骤S1捕捉的病毒粒子为模板，利用权利要求1所述的引物组进行LAMP扩增；S3.根据扩增结果判断病毒粒子待测样品中是否含有香蕉束顶病毒。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S1所述BBTV抗血清为多克隆抗体或单克隆抗体。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S2所述LAMP扩增的体系如下：10mmol/LdNTPs各4μL；5mol/L甜菜碱5μL；20mmol/LMgSO45μL；10×反应缓冲液5μL；25μmol/L引物BBTV-F3/BBTV-B3各0.2μL；50μmol/L引物BBTV-FIP/BBTV-BIP各0.8μL；8U/μLBst酶1μL；ddH2O补至25μL。6.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：饶雪琴，李华平，罗宝花，刘娟，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44