一种GyV9环形病毒VP3蛋白制备方法技术

本发明专利技术还提供了一种GyV9环形病毒VP3蛋白制备方法，该方法基于重组酶ExnaseTM II将线性化的pGEX‑6p‑1载体与GyV9病毒VP3基因片段PCR产物不经酶切连接反应，直接重组克隆技术；并转化到大肠杆菌，实现VP3蛋白表达；其中，PCR扩增所述的GyV9病毒VP3基因片段时所用引物的核苷酸序列如下：上游引物1：5’‑GTTCCAGGGGCCCATGGATGCGACGGGCAC‑3’；下游引物1：5’‑GTTTTCACCGTCATTACAATCTTGCGCCTT‑3’。该方法简化克隆过程，可快速构建GyV9病毒VP3基因的原核表达载体，实现VP3基因快速克隆表达。本发明专利技术获得的GyV9病毒VP3表达及纯化的蛋白，可直接提供VP3蛋白作为GyV9诊断抗原；作为免疫原获得抗VP3多克隆抗体；为开展GyV9流行病学调查提供有效诊断试剂；并为进一步探究VP3生物学功能具有重要意义。

Method for preparing GyV9 ring virus VP3 protein

The invention also provides a GyV9 ring virus VP3 protein, preparation method, the method of ExnaseTM II based on the recombinant enzyme linear pGEX 6p 1 vector and GyV9 fragment of PCR virus VP3 gene product without enzyme ligation reaction, direct cloning technology; and transformed into Escherichia coli, the expression of VP3 protein among them, PCR; GyV9 virus VP3 amplified the gene fragment of the nucleotide sequence of the primers used are as follows: 1:5 \GTTCCAGGGGCCCATGGATGCGACGGGCAC primer 3 '1:5'; downstream primer 3 'GTTTTCACCGTCATTACAATCTTGCGCCTT. The method can simplify the cloning process, construct the prokaryotic expression vector of the GyV9 gene of VP3, and realize the rapid cloning and expression of VP3 gene. Expression of GyV9 virus VP3 and the purified protein, can directly provide the VP3 protein as a diagnostic antigen GyV9; as immunogen to obtain anti VP3 polyclonal antibody; provide effective diagnostic reagents for the investigation of the epidemiology of GyV9; and has important significance to further explore the biological functions of VP3.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种GyV9环形病毒VP3蛋白的制备方法。
技术介绍
鸡传染性贫血病毒(ChickenInfectiousAnemiaVirus，CAV)一直被认为是圆环病毒科(Circoviridae)中环形病毒属(Gyrovirus)唯一成员。直到2011年，Rijsewijk等(RijsewijkFA,DosSantosHF,TeixeiraTF,CibulskiSP,VarelaAP,DezenD,etal.DiscoveryofagenomeofadistantrelativeofchickenanemiavirusrevealsanewmemberofthegenusGyrovirus.Archivesofvirology.2011Jun；156(6):1097-100)从发病鸡的血清样品中检测到新型环形病毒序列，即环形病毒属中第二个成员，命名为AGV2。同年，Sauvage等(SauvageV,ChevalJ,FoulongneV,GouilhMA,ParienteK,ManuguerraJC,etal.Identificationofthefirsthumangyrovirus,avirusrelatedtochickenanemiavirus.Journalofvirology.2011Aug；85(15):7948-50)在健康人的皮肤棉试样品中检测到首个与AGV2高度同源的人源环形病毒HGyV序列。自2012年，其它新型环形病毒包括GyV3，GyV4，GyV5，GyV6，GyV7，GyV8及GyV9被陆续发现鉴定，并具有潜在的公共卫生意义。然目前尚无检测GyV9抗原及其抗体的血清学方法。因此，对GyV9病毒早期表达蛋白VP3基因在体外进行克隆，构建VP3表达载体，实现其表达，将为深入开展GyV9蛋白抗原及其抗体检测、血清学调查，明确GyV9在鸡群以及人群中的感染复制情况提供有效诊断试剂；并为探究GyV9VP3生物学功能具有重要意义。在传统表达载体的构建中，往往需要设计选择限制性内切酶酶切位点，通过酶切、连接的方法构建载体，实现外源基因的表达。但有时由于找不到合适的酶切位点，往往导致克隆过程繁琐，效率低下。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供一种操作简单、效率高、快速的GyV9环形病毒VP3蛋白表达载体的制备方法，并实现VP3蛋白的表达。本专利技术的原理和最核心的关键技术是科学地设计扩增出GyV9病毒VP3基因片段的引物，利用商品化的重组酶ExnaseTMII不经酶切连接反应，直接在体外快速重组克隆VP3，转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达、实现GyV9的VP3蛋白与GST的融合表达，并获得纯化的VP3融合蛋白。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案具体如下：本专利技术提供了一种PCR扩增GyV9病毒VP3基因引物，其核苷酸序列为：上游引物1：5’-GTTCCAGGGGCCCATGGATGCGACGGGCAC-3’；下游引物1：5’-GTTTTCACCGTCATTACAATCTTGCGCCTT-3’。本专利技术还提供了一种GyV9环形病毒VP3蛋白制备方法，该方法基于重组酶ExnaseTMII将线性化的pGEX-6p-1载体与GyV9病毒VP3基因片段PCR产物不经酶切连接反应，直接重组克隆技术；并转化到大肠杆菌，实现VP3蛋白表达；其中，PCR扩增所述的GyV9病毒VP3基因片段时所用引物的核苷酸序列如上述所示。其具体包括如下步骤：1)PCR扩增pGEX-6p-1线性化载体以及GyV9病毒VP3基因片段：以pGEX-6p-1质粒以及GyV9病毒VP3基因为模板，设计引物，PCR分别扩增出含pGEX-6p-1线性化载体以及GyV9病毒VP3基因片段；其中，PCR扩增所述的GyV9病毒VP3基因片段时所用引物的核苷酸序列如上述所示；优选地，PCR扩增pGEX-6p-1线性化载体引物的核苷酸序列如下：上游引物2：5’-TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC-3’；下游引物2：5’-CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT-3’。2)将GyV9病毒VP3片段快速克隆进pGEX-6p-1载体：利用重组酶ExnaseTMII进行快速重组克隆；3)阳性克隆转化到大肠杆菌，实现VP3蛋白表达。本专利技术还提供了上述GyV9环形病毒VP3蛋白制备方法，以及上述的引物在制备GyV9诊断抗原、抗VP3多克隆抗体以及制备GyV9流行病学有效诊断试剂方面的应用。本专利技术的技术方案达到了如下的有益效果：该专利技术设计的引物及基于重组酶ExnaseTMII的克隆策略，简化克隆过程，可快速构建GyV9病毒VP3基因的原核表达载体，实现VP3基因快速克隆表达。使用本专利技术的方法，将获得GyV9环形病毒VP3蛋白表达载体，实现VP3基因在大肠杆菌中的表达，并获得纯化的VP3融合蛋白。本专利技术获得的GyV9病毒VP3表达及纯化的蛋白，可直接提供VP3蛋白作为GyV9诊断抗原；作为免疫原获得抗VP3多克隆抗体；为开展GyV9流行病学调查提供有效诊断试剂；并为进一步探究VP3生物学功能具有重要意义。这一表达载体构建及纯化的VP3融合蛋白将为建立检测GyV9抗原及抗体的血清学诊断方法，探究VP3生物学功能提供有效的免疫学试剂，填补国内外空白。因此，本专利技术具有一定应用价值。附图说明图1是一种GyV9环形病毒VP3蛋白制备方法策略。步骤1：以人工合成的GyV9病毒VP3基因为模板，利用表1中引物，PCR分别扩增出含pGEX-6p-1线性化载体以及GyV9病毒VP3基因片段。步骤2：利用重组酶ExnaseTMII进行快速重组克隆。步骤3：阳性克隆转化到大肠杆菌，实现VP3蛋白表达。图2是PCR扩增GyV9病毒VP3片段。泳道1，GyV9病毒VP3片段PCR产物；泳道M，DNAMarker。图3是PCR扩增线性化载体pGEX-6p-1。泳道1，线性化载体pGEX-6p-1的PCR产物；泳道M，DNAMarker。图4是SDS-PAGE分析GyV9病毒VP3基因的表达。泳道1，VP3超声裂解上清；泳道2，VP3超声裂解沉淀；泳道4，纯化的VP3蛋白；泳道5，GST超声裂解上清；泳道6，GST超声裂解沉淀；泳道M，蛋白Marker。图5是Westernblot鉴定抗GyV9VP3蛋白多克隆抗体。1,转染EGFP-VP3表达质粒的293T细胞裂解物；2，为转染对照EGFP表达质粒的293T细胞裂解物。具体实施方式为了阐明本专利技术的技术方案及技术目的，下面结合附图及具体实施方式对本专利技术做进一步的介绍。实施例11)设计扩增含pGEX-6p-1线性化载体以及GyV9病毒VP3基因片段引物：表1:扩增pGEX-6p-1线性化载体和GyV9病毒VP3片段引物设计:扩增pGEX-6p-1线性化载体上游引物位于pGEX-6p-1质粒1022-1047位；且在5’端带有额外TAA碱基；扩增pGEX-6p-1线性化载体下游引物位于pGEX-6p-1质粒916-941位；且在5’端带有额外CAT碱基。扩增GyV9病毒VP3基因上游引物包括VP3基因起始密码ATG及其后14个碱基，且在5’端带有16个与pGEX-6p-1线性化载体下游引物反向互补本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种PCR扩增GyV9病毒VP3基因引物，其特征在于，所述的引物的核苷酸序列为：上游引物1：5’‑GTTCCAGGGGCCCATGGATGCGACGGGCAC‑3’；下游引物1：5’‑GTTTTCACCGTCATTACAATCTTGCGCCTT‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种PCR扩增GyV9病毒VP3基因引物，其特征在于，所述的引物的核苷酸序列为：上游引物1：5’-GTTCCAGGGGCCCATGGATGCGACGGGCAC-3’；下游引物1：5’-GTTTTCACCGTCATTACAATCTTGCGCCTT-3’。2.一种GyV9环形病毒VP3蛋白制备方法，其特征在于，所述的方法基于重组酶ExnaseTMII将线性化的pGEX-6p-1载体与GyV9病毒VP3基因片段PCR产物不经酶切连接反应，直接重组克隆技术；并转化到大肠杆菌，实现VP3蛋白表达；其中，PCR扩增所述的GyV9病毒VP3基因片段时所用引物的核苷酸序列如权利要求1所示。3.如权利要求2所述的一种GyV9环形病毒VP3蛋白制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：1)PCR扩增pGEX-6p-1线性化载体以及GyV9病毒VP3基因片段：以pGEX-6p-1质粒以及GyV9病毒VP3基因为模板，设计引物，PCR分...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶建强，刘敏，姚晓慧，季星妤，韦芊含，邵红霞，秦爱建，田晓彦，万志敏，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32