海洋微生物菌株YS0810产的过氧化氢酶的基因克隆及表达制造技术

本发明专利技术涉及海洋微生物菌株YS0810产的过氧化氢酶的基因克隆及表达,该海洋过氧化氢酶基因序列及氨基酸序列如基因序列表所示，基因序列长度为1443bp。该过氧化氢酶可广泛被使用于食品加工、纺织、造纸、医械器具的消毒及抗肿瘤药物等领域中。

Cloning and expression of catalase gene from marine microorganism strain YS0810

The invention relates to the gene cloning and expression of catalase produced by marine microorganism strain YS0810. The gene sequence and the amino acid sequence of the marine catalase gene are as follows: the gene sequence length is 1443bp. The disinfection of catalase can be widely used in food processing, textile, papermaking, medical appliances and anti-tumor drugs etc..

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及海洋微生物
，特别是涉及一种海洋微生物菌株YS0810产的过氧化氢酶的基因克隆及表达。
技术介绍
微生物过氧化氢酶又称触酶(Catalase，缩称CAT)，普遍存在于好氧微生物体内,广泛分布于动物、植物和微生物中，清除机体内过量的H2O2，从而使细胞免于遭受H2O2的毒害作用，广泛应用于医药、食品、纺织、造纸和环保等产业中，具有广阔的应用价值，开发生产高效、经济并稳定性高的商品过氧化氢酶非常必要。近年来，过氧化氢酶在纺织工业中的应用而倍受关注，微生物过氧化氢酶必将成为过氧化氢酶工业化发展的重要方向。微生物过氧化氢酶种类多，且能适应各种不同的环境，由于海洋微生物为了适应海洋这一生命极限环境，如高压、低温、高盐等各种极端环境的过程中，海洋微生物酶表现比陆源微生物酶更有独特的生理功能与酶学特性，尤其是海洋微生物过氧化氢酶更具有独特的生理功能和特异的性质,其开发应用潜力巨大，愈来愈引起世界各国的重视与开发的一个热点。目前，已经获得基因序列的不同来源CAT至少有260多个。构建表达载体，导入相应受体细胞内，可以实现CAT的高表达，同时还能优化其性状。2011年周丽萍获得来自枯草芽孢杆菌的CAT基因，并将其在大肠杆菌JM109中进行表达，得到了重组大肠杆菌基因工程菌；2014年林峻将梅花鹿CAT的基因在大肠杆菌中进行了克隆与表达等等。商品过氧化氢酶主要来源于牛肝和经基因改良过的黑曲霉，但这些来源的过氧化氢酶稳定性不好。直接以海洋微生物Acinetobactersp.YS0810进行发酵制备高纯度过氧化氢酶存在培养基条件高和酶制备条件高等缺陷。专利
技术实现思路
本专利技术的目的在于以获得的海洋微生物菌株YS081所产的过氧化氢酶为基础,开发提供一种海洋微生物菌株YS0810产的碱性过氧化氢酶基因克隆及表达。本专利技术提供的海洋微生物菌株YS0810产的碱性过氧化氢酶基因克隆及表达为：一、海洋微生物YS0810过氧化氢酶的基因克隆：1、海洋微生物YS0810基因组DNA的提取海洋微生物YS0810的基因组DNA提取采用酚/氯仿提取法：(1)海洋微生物YS0810细菌培养接种活化菌种于5.0mL液体培养基(蛋白胨1wt％，牛肉膏1wt％，NaCl0.5wt％，调至pH7.2，121℃高压蒸汽灭菌30min。)中，37℃，220rpm，摇床培养12h,得细菌培养液。(2)菌体收集取上述细菌培养液至Eppendorf管中，室温12000g离心10min，弃上清，沉淀重新悬浮于1mLTE(pH8.0)中。(3)菌体裂解先加入50mg/mL的溶菌酶6μL，37℃作用2h。再加2MNaCl50μL，10wt％SDS(十二烷基磺酸钠)110μL，20mg/mL的蛋白酶K3μL，50℃作用3h，使菌体充分裂解,得菌体裂解液。(4)抽提菌体裂解液转至新的Eppendorf管中，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀后室温放置10min，12000g离心10min。抽提两次。(5)沉淀取上清液于新的Eppendorf管中，加0.6倍体积的异丙醇，混匀后室温放置10min，12000g离心10min，弃上清。(6)洗涤沉淀用75wt％的乙醇洗涤2次，弃上清后室温风干。(7)溶解沉淀溶于50μLTE缓冲液(10mMTris-HCl(pH8.0)，1mMEDTA(pH7.4)中，取2-5μL电泳，其余样品用作PCR模板。由上述提取基因组DNA溶液经过1％琼脂糖凝胶电泳观察其完整性和纯度,如图1，图中1是去除了RNA的基因组DNA,可以看出所提取的基因组完整、纯度高。2、PCR引物的设计根据所测海洋过氧化氢酶的N端序列N-SQDPKKCPVTHLTTE设计上游引物FF：ATGAGTCAAGACCCTAAAAAATG；根据与海洋过氧化氢酶的N端序列同源性较高的其它过氧化氢酶的C段序列C-ETDPAKGLPSFL设计下游引物FR，AAGAAAACTTGGTAAACCTTTAG；引物由上海生工生物技术有限公司合成。3、PCR扩增PCR反应体系(50μL)：PCR反应条件:预变性94℃，4min；变性94℃，1min；退火48℃，1min；延伸72℃，1min；30个循环后，72℃延伸7min。4、PCR结果观察取2μLPCR产物，在1×TAE配制加有适量GoldView的1wt％琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳电压100V，电泳时间30min，使用凝胶成像系统观察分析结果。利用引物FF和FR，以YS0810菌株基因组DNA为模板，进行PCR扩增，结果见图2，图中1为PCR结果：PCR克隆海洋过氧化氢酶基因全长片段大小约为1.5kb。5、PCR产物的胶回收将PCR所有产物加入琼脂糖凝胶上样孔中，100V电泳30min后，在紫外灯下切下目标带，用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化目标带，回收纯化操作过程如下(参照试剂盒说明书)。(1)将目的条带从电泳后的琼脂糖凝胶上切下来，称取质量后放入干净的离心管中。(2)离心管中加入3倍体积的溶胶液，50℃保温10min,须确保胶块完全溶解。(3)将上述溶胶液转移至吸附柱中,室温12000g离心30s,弃废液。(4)吸附柱中加入漂洗液700μL,室温12000g离心30s,弃废液。(5)吸附柱中加入500μL漂洗液,室温12000g离心30s,弃废液，吸附柱13000g离心2min，弃废液。(6)将吸附柱放至一个干净的离心管中，向吸附柱中间悬空滴加洗脱液40μL,室温放置2min,12000g离心2min，离心管中的溶液即为PCR胶回收产物。6、PCR胶回收产物与T载体连接PCR扩增过程中，TaqDNA聚合酶在双链DNA3’末端增加一个腺嘌呤核苷酸(A)，从而使扩增产物具有A突出末端。因此可将PCR产物与含有T末端的pEASY-T1连接载体连接。连接体系(10μL)：25℃连接2小时。7、CaCl2制备大肠杆菌感受态CaCl2制备大肠杆菌感受态制备步骤如下：(1)从LB平板(37℃，培养16-20h)上挑取一个大肠杆菌DH5α单菌落，转到含有25mLLB培养基(在LB液体培养基中加入琼脂粉，终浓度2wt％，121℃蒸汽灭菌20min，倒入平板中，冷却。)的三角瓶(250mL)中，37℃，300r/min，摇床震荡培养。(2)当培养液OD600nm达到0.5时，培养物冰浴10min，4℃下2500g离心10min。(3)收集菌体，弃培养液。(4)用40mL冰浴的100mMCaCl2-MgCl2溶液(80mMMgCl2，20mMCaCl2)轻轻重悬菌体。(5)4℃下2500g离心10min，回收菌体。(6)倒尽培养液，用2mL冰浴的100mMCaCl2重悬菌体。(7)吸取100μL细胞悬液分装至无菌离心管中，液氮速冻后-80℃冷冻保藏。8、大肠杆菌的转化将后琼脂糖凝胶回收的PCR产物与T载体连接，所得重组体转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，具体转化步骤如下：(1)制备好的DH5α感受态细胞冰浴解冻后，每管加入待转化的DNA，混匀后冰上放置30min。(2)离心管放至42℃水浴中准确计时90s。(3)快速将离心管转移至冰上，放置2min。(4)加LB液体培养基750μL至离心管中，然后将管本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种海洋微生物菌株YS0810产的过氧化氢酶的基因克隆及表达，其特征在于该海洋过氧化氢酶的基因序列及氨基酸序列如基因序列表所示。

【技术特征摘要】
1.一种海洋微生物菌株YS0810产的过氧化氢酶的基因克隆及表达，...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙谧，郝建华，王伟，付新华，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37