Tregs相关因子的检测方法及SAM联合沙利度胺在抗肿瘤免疫中的应用技术

本发明专利技术涉及肝癌的治疗及预后判断技术领域，具体公开一种Tregs相关因子的检测方法及SAM联合沙利度胺在抗肿瘤免疫中的应用，检测方法包括体外检测和体内检测，在检测过程中选取最佳作用浓度做为联合用药组的干预浓度；体外培养肝癌HepG2细胞，选取对数生长期的细胞，随机分成4组：空白对照组、SAM组、沙利度胺组、以及联合用药组，检测各因子的情况及变化；用H22肝癌腹水瘤细胞构建荷瘤肝癌小鼠模型，小鼠随机分为4组：生理盐水组、SAM组、沙利度胺组，沙利度胺联合SAM组，连续腹腔注射10d，每隔7d测量移植瘤长短径，检测各因子的情况及变化。本发明专利技术的优点是，明确S‑腺苷蛋氨酸、沙利度胺联合应用对于肝癌细胞增值、迁移和凋亡的效果，SAM联合沙利度胺共同限制Tregs活性，增强抗肿瘤免疫效果。

Detection of Tregs related factors and application of SAM combined with thalidomide in antitumor immunity

The present invention relates to the treatment and prognosis of hepatocellular carcinoma specific application technology field, discloses a Tregs related factor detection method and SAM combined with thalidomide in antitumor immunity, including in vitro and in vivo detection and detection method of detection, the intervention concentration of the best concentration for the combination group in the detection of hepatocellular carcinoma HepG2 cells; in vitro selection of logarithmic growth phase were randomly divided into 4 groups: control group, SAM group, thalidomide group and combination group, the detection and the change of each factor; construct nude mice model of hepatocellular carcinoma with H22 ascites tumor cells, mice were randomly divided into 4 groups: saline group, SAM group, thalidomide group, thalidomide group SAM, intraperitoneal injection of 10d, every 7d measured the tumor size, detection and the change of each factor. The invention has the advantages of clear, S ademetionine, thalidomide combined application effect on migration and apoptosis of hepatocellular carcinoma cell proliferation, and SAM combined with thalidomide limited Tregs activity, enhance the effect of antitumor immunity.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及肝癌的治疗及预后判断
，特别是指一种Tregs相关因子的检测方法及SAM联合沙利度胺在抗肿瘤免疫中的应用。
技术介绍
原发性肝癌(primarycarcinomaoftheliver，以下简称肝癌)是我国常见的恶性肿瘤之一，目前治疗手段有限、预后差。近年来研究认为肿瘤的发生、发展存在免疫微环境的紊乱，调节性T细胞(Treg)由于能够维持机体免疫耐受，在防止自身免疫病的发生、抗移植物排斥以及肿瘤免疫等方面均有重要意义。Foxp3被认为是Treg细胞发育和功能维持的主要调节基因，能增强Treg细胞的免疫抑制功能，下调机体抗肿瘤免疫应答。研究发现Foxp3在肝癌的发病中起到很重要的作用。DNA甲基化是重要的表观遗传学改变之一，尤其是抑癌基因启动子区的高甲基化,可直接阻碍转录因子与启动子结合,从而使抑癌基因不能转录或转录水平降低。乙型肝炎病毒(HBV)感染是原发性肝癌的首要病因，有研究认为乙肝病毒X蛋白(HBx)通过激活DNA甲基化转移酶1使抑癌基因甲基化，从而影响其表达而促进肝癌的发生。而Foxp3的甲基化状态决定能否产生稳定功能的Treg细胞发挥其肿瘤免疫的功能，目前关于Foxp3基因甲基化状态与肝癌发病机制的关系国内外尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种Tregs相关因子的检测方法及SAM联合沙利度胺在抗肿瘤免疫中的应用，明确S-腺苷蛋氨酸、沙利度胺联合应用对于肝癌细胞增值、迁移和凋亡的效果。为了实现上述目的，本专利技术采用了以下的技术方案：Tregs相关因子的检测方法包括体外检测和体内检测，在检测过程中选取最佳作用浓度做为联合用药组的干预浓度；体外检测：体外培养肝癌HepG2细胞，选取对数生长期的细胞，随机分成4组：空白对照组、SAM组(2、4、6mmol/L)、沙利度胺组(50、100、200μg/ml)、以及联合用药组(SAM与沙利度胺联合)，具体包括以下步骤：1)MTT实验观察空白对照组、SAM组、沙利度胺组作用24、48、72h后细胞的生长曲线、Transwell实验观察细胞运动能力的变化、流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况，使用上述方法检测联合用药组作用24、48、72h后细胞的增值、迁移及凋亡情况；2)采用流式细胞术检测4组作用48h后，Tregs相关细胞因子CD4+CD25+T细胞、TGF-β、IL-10的表达；3)利用RT-PCR方法检测4组作用48h后，Foxp3mRNA、NF-κβ表达；4)焦磷酸测序法检测4组作用48h后，Foxp3启动子区甲基化水平的变化；体内检测：用H22肝癌腹水瘤细胞构建荷瘤肝癌小鼠模型，40只模型小鼠随机分为4组，每组10只：生理盐水组、SAM组、沙利度胺组，沙利度胺联合SAM组，连续腹腔注射10d，每隔7d测量移植瘤长短径，并于第28天处死小鼠，具体包括以下步骤：1)采用流式细胞术检测外周血Tregs百分比、以及相关细胞因子TGF-β、IL-10的表达；2)用RT-PCR方法检测各组移植瘤组织Foxp3、NF-κβmRNA含量；3)焦磷酸测序法检测各组移植瘤组织Foxp3启动子区甲基化水平的变化；4)免疫组化检测各组移植瘤组织Foxp3、NF-κβ蛋白表达。SAM联合沙利度胺在抗肿瘤免疫中的应用，SAM联合沙利度胺共同限制Tregs活性，增强抗肿瘤免疫效果。本专利技术的有益效果在于：SAM、沙利度胺通过不同途径均可能限制Tregs活性增强抗肿瘤免疫，联合使用副作用小并可以显著增强效果，为肝癌的治疗提供新的思路。Foxp3在不同肿瘤中表达水平不一，在肝癌患者体内其水平是升高的且影响肝癌进展，而Foxp3的表达和功能发挥的稳定性都与甲基化有关，改变Foxp3甲基化可调控其表达及功能发挥而达到免疫治疗的作用，因此研究Foxp3基因的甲基化在肝癌细胞中的表达对进一步探讨肝癌的发病机制及治疗是非常必要的。首次将两药连用，通过对比两药单用、联合使用对肝癌细胞中Tregs以及相关炎症因子的影响，探讨造成这一差异的机制，为临床治疗肝癌、改善预后提供新思路。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对-实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为Tregs相关因子的检测方法框架图；图2为Foxp3基因的表观遗传调控示意图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。Tregs相关因子的检测方法包括体外检测和体内检测，在检测过程中选取最佳作用浓度做为联合用药组的干预浓度；体外检测：体外培养肝癌HepG2细胞，选取对数生长期的细胞，随机分成4组：空白对照组、SAM(2、4、6mmol/L)、沙利度胺组(50、100、200μg/ml)、以及联合用药组；1)MTT实验观察空白对照组、SAM、沙利度胺组作用24、48、72h后细胞的生长曲线、Transwell实验观察细胞运动能力的变化、流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况，选取最佳作用浓度做为联合用药组干预浓度，使用上述方法检测联合用药组作用24、48、72h后细胞的增值、迁移及凋亡情况；2)采用流式细胞术检测4组作用48h后，Tregs相关细胞因子CD4+CD25+T细胞、TGF-β、IL-10的表达；3)利用RT-PCR方法检测4组作用48h后，Foxp3mRNA、NF-κβ表达；4)焦磷酸测序法检测4组作用48h后，Foxp3启动子区甲基化水平的变化。体内检测：用H22肝癌腹水瘤细胞构建荷瘤肝癌小鼠模型。40只模型小鼠随机分为4组，每组10只：生理盐水组、SAM组、沙利度胺组，沙利度胺联合SAM组，连续腹腔注射10d，每隔7d测量移植瘤长短径，并于第28天处死小鼠；1)采用流式细胞术检测外周血Tregs百分比、以及相关细胞因子TGF-β、IL-10的表达；2)用RT-PCR方法检测各组移植瘤组织Foxp3、NF-κβmRNA含量；3)焦磷酸测序法检测各组移植瘤组织Foxp3启动子区甲基化水平的变化；4)免疫组化检测各组移植瘤组织Foxp3、NF-κβ蛋白表达。通过体内及体外实验发现沙利度胺有免疫调节、抑制肿瘤新生血管生成、抑制肿瘤坏死因子等作用，在治疗多发性骨髓瘤中取得的良好疗效，FDA已批准其用于该病的一线治疗，在前列腺癌、恶性神经胶质瘤、小细胞肺癌、肾癌、肝癌等恶性实体瘤的治疗也取得了一些新的进展，沙利度胺能明显抑制小鼠肝癌组织内血管生成和VEGF分泌，从而抑制肝癌的生长。国外有研究发现沙利度胺通过调控NF-κB蛋白限制Tregs活性治疗慢性淋巴细胞性白血病，NF-κB是一种广泛存在于哺乳动物细胞中的重要转录调控因子，由五个成员组成：c-Rel、NF-κB1(P50)、NF-κB2(p52)、RelA(p65本文档来自技高网...

【技术保护点】
Tregs相关因子的检测方法，其特征在于：包括体外检测和体内检测，在检测过程中选取最佳作用浓度做为联合用药组的干预浓度；体外检测：体外培养肝癌HepG2细胞，选取对数生长期的细胞，随机分成4组：空白对照组、SAM组(2、4、6mmol/L)、沙利度胺组(50、100、200μg/ml)、以及联合用药组(SAM与沙利度胺联合)，具体包括以下步骤：1)MTT实验观察空白对照组、SAM组、沙利度胺组作用24、48、72h后细胞的生长曲线、Transwell实验观察细胞运动能力的变化、流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况，选取最佳作用浓度做为联合用药组干预浓度，使用上述方法检测联合用药组作用24、48、72h后细胞的增值、迁移及凋亡情况；2)采用流式细胞术检测4组作用48h后，Tregs相关细胞因子CD4+CD25+T细胞、TGF‑β、IL‑10的表达；3)利用RT‑PCR方法检测4组作用48h后，Foxp3mRNA、NF‑κβ表达；4)焦磷酸测序法检测4组作用48h后，Foxp3启动子区甲基化水平的变化；体内检测：用H22肝癌腹水瘤细胞构建荷瘤肝癌小鼠模型，40只模型小鼠随机分为4组，每组10只：生理盐水组、SAM组、沙利度胺组，沙利度胺联合SAM组，连续腹腔注射10d，每隔7d测量移植瘤长短径，并于第28天处死小鼠，具体包括以下步骤：1)采用流式细胞术检测外周血Tregs百分比、以及相关细胞因子TGF‑β、IL‑10的表达；2)用RT‑PCR方法检测各组移植瘤组织Foxp3、NF‑κβmRNA含量；3)焦磷酸测序法检测各组移植瘤组织Foxp3启动子区甲基化水平的变化；4)免疫组化检测各组移植瘤组织Foxp3、NF‑κβ蛋白表达。...

【技术特征摘要】
1.Tregs相关因子的检测方法，其特征在于：包括体外检测和体内检测，在检测过程中选取最佳作用浓度做为联合用药组的干预浓度；体外检测：体外培养肝癌HepG2细胞，选取对数生长期的细胞，随机分成4组：空白对照组、SAM组(2、4、6mmol/L)、沙利度胺组(50、100、200μg/ml)、以及联合用药组(SAM与沙利度胺联合)，具体包括以下步骤：1)MTT实验观察空白对照组、SAM组、沙利度胺组作用24、48、72h后细胞的生长曲线、Transwell实验观察细胞运动能力的变化、流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况，选取最佳作用浓度做为联合用药组干预浓度，使用上述方法检测联合用药组作用24、48、72h后细胞的增值、迁移及凋亡情况；2)采用流式细胞术检测4组作用48h后，Tregs相关细胞因子CD4+CD25+T细胞、TGF-β、IL-10的表达；3)利用RT-PCR方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：党珊，
申请(专利权)人：党珊，
类型：发明
国别省市：陕西;61