抗黄体酮类兔单克降抗体的制备方法及其用途技术

本发明专利技术公开了一种抗黄体酮类兔単克降抗体的制各方法及其用途。本发明专利技术选取黄体酮类药物与载体蛋白牛血清白蛋白偶联合成免疫抗原，将这种免疫抗原采用背部皮下注射免疫兔子，经过杂交瘤技术，最终得到抗黄体酮类兔単克降抗体。本发明专利技术制备的抗体为兔单克降抗体，兔单克降的制备优于鼠单克降抗体。兔子相比于小鼠可以识别更多免疫抗原的表位。其次，兔脾脏较大可以进行更多的融合实验，使高通量筛选融合细胞成为可能。本发明专利技术可用于食品、饲料及环境样品中的黄体酮类药物的残留检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫化学
，尤其涉及一种抗黄体酮类兔单克隆抗体的制备方法及其用途。
技术介绍
黄体酮类(progesterone)由卵巢黄体分泌的一种天然孕激素，在体内对雌激素激发过的子宫内膜有显著形态学影响，为维持妊娠所必需。临床用于黄体功能不全、经前期综合征、继发性闭经等。黄体酮具有吸收好，半衰期长，抗菌谱广等优点，已成为兽医临床常用药品。但由于该类药物长期和广泛的应用，造成言产品中药物大量残留，引起了一系列的负面影响，不仅直按危害人类健康，而且不利于养殖业的健康发展及畜禽产品出口。包括中国在内的很多国家都针对某一具体黄体酮在动物性食品中的使用而制定了最高残留限量(MRL)，其残留问题已引起广泛的关注。近年来随着抗黄体酮类药物在临床上的大量广泛使用，其残留问题也越来越严重。在国内外用于黄体酮药物残留检测的方法较多，有微生物法、免疫分析测定法、高效液相色谱法、高效毛细管电泳法、薄层色谱法、荧光分光光度法等。免疫分析测定法适用于大规模检测和筛选。ELISA方法灵敏度较高，特异性较强，测定方法筒单快速，可同时筛选大量样品。目前常将ELISA法作为筛选法，高效液相色谱一质谱法作为确证方法配套使用。兔单克降抗体较常规的鼠单克降抗体具有更多优点。首先，兔子相比于小鼠能识别更多免疫抗原的表位。其次，由于兔脾脏较大，可以进行更多的融合实验，使得高通量筛选融合细胞成为可能。因此，需要对现有技术进行改进。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术存在的以上需求，提出一种抗黄体酮类兔单克隆抗体的制备方法及其用途。抗黄体酮类兔单克降抗体的制备方法，制备步骤如下：1)、将40mg黄体酮溶解于1mL的二甲基甲酰胺和1mL二氧六环中，4℃预冷后，加入30μL三丁胺，冰浴10分钟后加入40μL氯甲酸异丁西言，反应20分钟，得到黄体酮溶液反应液，将80mg牛血清白蛋白溶解于8mlpH9.6碳酸缓冲液中，得到牛血清白蛋白溶液，将黄体酮溶液反应液滴加到牛血清白蛋白溶液中，磁力搅拌反应4h，用磷酸盐缓冲液透析，得到黄体酮免疫抗原，-20℃保存；2)、将这种免疫抗原釆用背部皮下注射混和免疫兔子，免疫前取血2m1，第一次免疫将黄体酮免疫抗原0.5mg与等量弗氏完全佐剂混和后进行免疫，第二次至第五次免疫将这种免疫抗原各0.25mg与等量弗氏不完全佐剂混和后进行免疫，免疫问隔两周，加强免疫安排在第五次免疫后的4-8周内，将黄体酮免疫抗原0.5mg静脉注射，注射后4天杀兔子，取脾备用；3)、无菌取脾脏，分离脾脏细胞，分离脾脏细胞的步骤为:在培养皿中去除脾脏周围的脂肪和其他组织；用1640培养液冲洗后，将脾脏置于不锈钢筛网上，挤压过筛；用1640培养液悬浮后高心，1400rpm，5min；弃上清，重复洗涤一次；用1640培养液重悬细胞，取少量细胞悬液稀释；用台盼蓝染色计算活细胞数；根据细胞计数，取含2X108个脾淋巴细胞的悬液备用；4)、将脾脏细胞与240E细胞进行细胞融合，240E细胞是在细胞融合实验前一周传代培养的，融合当天收集生长旺盛、正处于对数生长期的240E细胞与免疫免子的脾细胞融合，融合剂为50％的聚乙二醇，细胞融合前取240E细胞培养上清作为阴性上清对照；5)、融合后的细胞用HAT作为选择性培养基，分装于加有饲养细胞的40块96孔细胞培养板中，置37℃、6％C02培养箱内培养，2-3周初检，取细胞培养孔上清，用间接ELISA法筛选出阳性克隆，将初检阳性的杂交瘤细胞转移至24孔细胞培养板中，一周后，采用间接ELISA法、间接竞争ELISA法筛选出分泌抗体亲和力强，细胞生长状态良好的杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞在液氮中保存一份，一份用有限稀释法进行克降化，每个多克降分装于3块96孔细胞培养板中，三周后用间接ELISA法筛选出阳性克隆，每个多克隆选大于3个阳性孔，转移至24孔细胞培养板中，一周后，采用间接ELISA法、间接竞争ELISA法筛选出分泌抗体亲和力强，细胞生长状态良好的杂交瘤细胞，将该杂交瘤细胞在液氮中保存一份，一份用于扩大培养生产抗黄体酮类兔单克降抗体；作为本专利技术抗黄体酮类兔单克降抗体的制备方法的改进：将免疫兔子的脾脏细胞与240E细胞融合步骤为:分别取2×108个脾淋巴细胞和1x108个240E细胞混匀，加1640培养液后离心，弃上清，使两种细胞充分混匀成糊状，37℃水浴预温，缓缓加入经37℃预温的50％聚乙二醇溶液，再加入经37℃预温的1640培养液，使聚乙二醇稀释而失去作用，补加1640培养液后离心，弃上清，将融合后的细胞沉旋悬浮于HAT培养液中；作为本专利技术抗黄体酮类兔单克降抗体的制备方法的进一步改进：黄体酮类药物结构通式为：抗黄体酮类兔单克隆抗体的用途：用于制备检测黄体酮类药物残留的ELISA检测试剂金；作为本专利技术抗黄体酮类兔单克降抗体的制备方法的改进：用于制备黄体酮类药物多残留的胶体金检测试剂盒；作为本专利技术抗黄体酮类兔单克降抗体的制备方法的进一步改进：用于检测食品、饲料及环境样品中的黄体酮类药物的残留。本专利技术的优点是：本专利技术制备的抗黄体酮类単克隆抗体为兔単克隆抗体，兔单克隆抗体较常规的鼠单克降抗体具有更多优点。兔子相比于小鼠会识别更多免疫抗原的表位。其次，由于兔脾脏较大，可以进行更多的融合实验，使得高通量筛选融合细胞成为可能。本专利技术制备的抗体为抗黄体酮类的抗体，其较常规特异于单种药物的抗体，具有更高的广谱性，可以用于多药物的残余检测。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。图1为本专利技术抗黄体酮类兔单克降抗体的制备方法及其用途的黄体酮类药物抑制标准曲线。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此。实施例、抗黄体酮类兔单克降抗体的制备方法及其用途，如图1所示，将40mg黄体酮溶解于1mL的二甲基甲酰胺和1mL二氧六环中，4℃预冷后，加入30μL三丁胺，冰浴10分钟后加入40μL氯甲酸异丁西言，反应20分钟，得到黄体酮溶液反应液，将80mg牛血清白蛋白溶解于8mlpH9.6碳酸缓冲液中，得到牛血清白蛋白溶液，将黄体酮溶液反应液滴加到牛血清白蛋白溶液中，磁力搅拌反应4h，用磷酸盐缓冲液透析，得到黄体酮免疫抗原，-20℃保存；将这种免疫抗原釆用背部皮下注射混和免疫兔子，免疫前取血2m1，第一次免疫将黄体酮免疫抗原0.5mg与等量弗氏完全佐剂混和后进行免疫，第二次至第五次免疫将这种免疫抗原0.25mg与等量弗氏不完全佐剂混和后进行免疫，免疫问隔两周，加强免疫安排在第五次免疫后的4-8周内，将黄体酮免疫抗原0.5mg静脉注射，注射后4天杀兔子，取脾备用；无菌取脾脏，分离脾脏细胞，分离脾脏细胞的步骤为:在培养皿中去除脾脏周围的脂肪和其他组织；用1640培养液冲洗后，将脾脏置于不锈钢筛网上，挤压过筛；用1640培养液悬浮后高心，1400rpm，5min；弃上清，重复洗涤一次；用1640培养液重悬细胞，取少量细胞悬液稀释；用台盼蓝染色计算活细胞数；根据细胞计数，取含2X108个脾淋巴细胞的悬液备用；将脾脏细胞与240E细胞进行细胞融合，240E细胞是在细胞融合实验前一周传代培养的，融合当天收集生长旺盛、正处于对数生长期的240E细胞与免疫免子的脾细胞融合，融合剂为50本文档来自技高网...

【技术保护点】
抗黄体酮类兔单克降抗体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：1)、将40mg黄体酮溶解于1mL的二甲基甲酰胺和1mL二氧六环中，4℃预冷后，加入30μL三丁胺，冰浴10分钟后加入40μL氯甲酸异丁西言，反应20分钟，得到黄体酮溶液反应液，将80mg牛血清白蛋白溶解于8mlpH9.6碳酸缓冲液中，得到牛血清白蛋白溶液，将黄体酮溶液反应液滴加到牛血清白蛋白溶液中，磁力搅拌反应4h，用磷酸盐缓冲液透析，得到黄体酮免疫抗原，‑20℃保存；2)、将这种免疫抗原釆用背部皮下注射混和免疫兔子，免疫前取血2m1，第一次免疫将黄体酮免疫抗原0.5mg与等量弗氏完全佐剂混和后进行免疫，第二次至第五次免疫将这种免疫抗原各0.25mg与等量弗氏不完全佐剂混和后进行免疫，免疫问隔两周，加强免疫安排在第五次免疫后的4‑8周内，将黄体酮免疫抗原0.5mg静脉注射，注射后4天杀兔子，取脾备用；3)、无菌取脾脏，分离脾脏细胞，分离脾脏细胞的步骤为:在培养皿中去除脾脏周围的脂肪和其他组织；用1640培养液冲洗后，将脾脏置于不锈钢筛网上，挤压过筛；用1640培养液悬浮后高心，1400rpm，5min；弃上清，重复洗涤一次；用1640培养液重悬细胞，取少量细胞悬液稀释；用台盼蓝染色计算活细胞数；根据细胞计数，取含2X108个脾淋巴细胞的悬液备用；4)、将脾脏细胞与240E细胞进行细胞融合，240E细胞是在细胞融合实验前一周传代培养的，融合当天收集生长旺盛、正处于对数生长期的240E细胞与免疫免子的脾细胞融合，融合剂为50％的聚乙二醇，细胞融合前取240E细胞培养上清作为阴性上清对照；5)、融合后的细胞用HAT作为选择性培养基，分装于加有饲养细胞的40块96孔细胞培养板中，置37℃、6％C02培养箱内培养，2‑3周初检，取细胞培养孔上清，用间接ELISA法筛选出阳性克隆，将初检阳性的杂交瘤细胞转移至24孔细胞培养板中，一周后，采用间接ELISA法、间接竞争ELISA法筛选出分泌抗体亲和力强，细胞生长状态良好的杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞在液氮中保存一份，一份用有限稀释法进行克降化，每个多克降分装于3块96孔细胞培养板中，三周后用间接ELISA法筛选出阳性克隆，每个多克隆选大于3个阳性孔，转移至24孔细胞培养板中，一周后，采用间接ELISA法、间接竞争ELISA法筛选出分泌抗体亲和力强，细胞生长状态良好的杂交瘤细胞，将该杂交瘤细胞在液氮中保存一份，一份用于扩大培养生产抗黄体酮类兔单克降抗体。...

【技术特征摘要】
1.抗黄体酮类兔单克降抗体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：1)、将40mg黄体酮溶解于1mL的二甲基甲酰胺和1mL二氧六环中，4℃预冷后，加入30μL三丁胺，冰浴10分钟后加入40μL氯甲酸异丁西言，反应20分钟，得到黄体酮溶液反应液，将80mg牛血清白蛋白溶解于8mlpH9.6碳酸缓冲液中，得到牛血清白蛋白溶液，将黄体酮溶液反应液滴加到牛血清白蛋白溶液中，磁力搅拌反应4h，用磷酸盐缓冲液透析，得到黄体酮免疫抗原，-20℃保存；2)、将这种免疫抗原釆用背部皮下注射混和免疫兔子，免疫前取血2m1，第一次免疫将黄体酮免疫抗原0.5mg与等量弗氏完全佐剂混和后进行免疫，第二次至第五次免疫将这种免疫抗原各0.25mg与等量弗氏不完全佐剂混和后进行免疫，免疫问隔两周，加强免疫安排在第五次免疫后的4-8周内，将黄体酮免疫抗原0.5mg静脉注射，注射后4天杀兔子，取脾备用；3)、无菌取脾脏，分离脾脏细胞，分离脾脏细胞的步骤为:在培养皿中去除脾脏周围的脂肪和其他组织；用1640培养液冲洗后，将脾脏置于不锈钢筛网上，挤压过筛；用1640培养液悬浮后高心，1400rpm，5min；弃上清，重复洗涤一次；用1640培养液重悬细胞，取少量细胞悬液稀释；用台盼蓝染色计算活细胞数；根据细胞计数，取含2X108个脾淋巴细胞的悬液备用；4)、将脾脏细胞与240E细胞进行细胞融合，240E细胞是在细胞融合实验前一周传代培养的，融合当天收集生长旺盛、正处于对数生长期的240E细胞与免疫免子的脾细胞融合，融合剂为50％的聚乙二醇，细胞融合前取240E细胞培养上清作为阴性上清对照；5)、融合后的细胞用HAT作为选择性培养基，分装于加有饲养细胞的40块96孔细胞培养板中，置37℃、6...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑晓冬，李洪波，楚强，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33