本发明专利技术涉及一种核仁素靶向的明胶/硅氧烷‑siRNA纳米复合物及其制备方法，属于生物技术领域，通过制备得到GS纳米粒子，为GS纳米粒子表面氨基的活化，利用巯基化的GS纳米粒子合成GS‑适配体纳米粒子，最后负载siRNA得到纳米明胶/硅氧烷‑siRNA复合物。本发明专利技术方法能有效的将siRNA负载于纳米明胶/硅氧烷上，具有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种核仁素靶向的明胶/硅氧烷-siRNA纳米复合物及其制备方法。
技术介绍
基因治疗是指将具有治疗作用的基因类物质导入细胞以纠正导致病变的缺陷基因。早在1972年，Friedmann和Roblin就提出将基因治疗用于人类的遗传性疾病。在2000年，Cavazzana-Calvo等在巴黎首次成功地实现了对多种免疫缺陷综合症-X1(SCID-X1)病人进行基因治疗。到2002年，Aiuti等人在米兰也成功实现了对腺苷脱氨酶-多重免疫综合症(ADA-SCID)患者的治疗。由于人类基因计划取得的进展，后基因组计划，功能基因组计划，以及蛋白质组计划等等被相继提出。人们对自己的遗传背景有了更清楚的认识，特别是对基因与疾病的关系有了进一步而具体的了解。因此基因治疗具有了更为广阔的应用前景。随着RNA干扰效应的发现以及随之而来的RNA干扰技术的发展，基因治疗不再仅仅意味着将外源基因导入细胞基因组中，还包括了通过siRNA或shRNA对内源基因的调控。siRNA用于基因治疗有一些特别的优势，在不需要对基因进行长期抑制的治疗中，如病毒感染，随着病毒基因被抑制，siRNA干扰效应会消失，因此可以用作病毒感染的辅助治疗。然而，由于siRNA存在着体内易降解的问题。选择合适的载体递送siRNA成为必须解决的问题。靶向型非病毒载体基因载体不仅能提高转染效率，而且能降低由于非特异性的基因转染引起的副作用。利用抗体与细胞膜上的特定抗原相互作用是一个有效的手段。此外，DNA或RNA链能形成与特定分子相结合的三维结构，即适配体，也被用来修饰各类基因载体以靶向特定细胞。因为适配体是一段核酸序列，相比于蛋白抗体来说具有合成简单，成本较低并且比较稳定的优点。本专利技术采用的被称为AGRO100的适配体是一段富含鸟嘌呤(G)的DNA链，具有很好的抗核酸酶稳定性。有报道表明这种适配体能与Nuclein蛋白——一种能在多种癌细胞的细胞膜表面表达量上调的特征蛋白——特异性结合，并且这种适配体本身也具有了一定的抑癌作用，已被用于临床试验。本专利技术通过二硫键将AGRO100适配体与siRNA连接到GS纳米粒子表面以赋予siRNA纳米载体肿瘤细胞靶向性。流式细胞仪及激光共聚焦检测表明AGRO100-GS纳米粒子能特异靶向人肺腺癌A549细胞。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种核仁素靶向的明胶/硅氧烷-siRNA纳米复合物及其制备方法，以明胶硅氧烷(GS)纳米粒子为载体，我们通过二硫键将AGRO100适配体和siRNA同时连接到GS纳米粒子表面。本专利技术具体通过以下技术方案实现：一种核仁素靶向的明胶/硅氧烷-siRNA纳米复合物的制备方法，具体包括以下步骤；1)向盐酸溶液中加入明胶配制成明胶溶液，向明胶溶液中加入3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(GPSM)，60℃的条件恒温搅拌30min，然后向反应体系中加入3-(三甲氧基硅烷)丙胺(APTMS)，继续搅拌8-9小时，将得到的悬浮液离心超声洗涤三次后即可得到明胶硅氧烷(GS)纳米粒子；2)将巯基化试剂Traut’sreagent加入悬液中振荡反应12小时，随后超声离心得到巯基化的GS纳米粒子；3)将得到的GS离心弃去上清，将GS超声重悬于含有Na3PO4、NaCl、pH＝7.2的溶液中配成浓度为5mg/ml的悬浊液，将SPDP用甲基亚砜(DMSO)溶解，配成20mM的浓度，将3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)溶液加入GS悬液中振荡反应1小时；4)将GS-SPDP离心12min后弃去上清液，将GS-SPDP重悬于含有Na3PO4、NaCl、EDTA、pH＝7.2的溶液中，浓度为2mg/ml，将用同样溶液溶解的适配体分子加入悬浊液中，振荡反应12小时后离心收集适配体-GS纳米粒子，将纳米粒子在PBS中反复超声重悬离心2次以洗去非共价吸附在GS表面的适配体分子；5)将巯基化的siRNA的正义链连接到GS上，再将反义链加入反应体系中退火形成双链结构。本专利技术步骤(1)中所述的盐酸溶液pH为3，明胶溶液浓度为0.75％。本专利技术步骤(1)中所述的GPSM与明胶溶液的质量体积比为10:1。本专利技术步骤(1)中所述的APTMS与GPSM的质量比为2:5。本专利技术步骤(2)中所述的Traut’sreagent以GS/Traut’s试剂质量比7/1的关系加入悬液。本专利技术步骤(3)中所述的Na3PO4、NaCl的浓度分别为50mM、0.15M；所述的SPDP溶液以25L/2-5mg的比例加入GS悬液中。本专利技术步骤(4)中所述的Na3PO4、NaCl、EDTA的浓度分别为50mM、0.15M、10mM。本专利技术还保护通过以上方法制备得到的纳米明胶/硅氧烷-siRNA复合物。本专利技术的有益效果为：本专利技术通过将siRNA正义链先连接到纳米粒子上再通过退火形成siRNA双链的方法能有效负载siRNA分子，本专利技术方法采用这种方法合成的纳米粒子加入点样孔中有较强的荧光，表明siRNA能有效的连接在GS或GS-HA2上，二硫苏糖醇(DTT)还原二硫键之后在相应泳道中也能观察到siRNA双链的存在。附图说明图1是流式细胞仪检测AGRO100适配体和空白核苷酸(TDO)对A549(a)及Hela(b)细胞的靶向性；图2是加入不同比例的适配体/GS后适配体实际的连接量(a)和连接比例(b)图3是激光共聚焦图像显示AGRO100-GS和TDO-GS纳米粒子内化进入A549或成纤维细胞的情况；图4是共培养时间对AGRO100-GS纳米粒子内化进入A549细胞的影响；图5是共培养时间对AGRO100-GS纳米粒子内化进入成纤维细胞的影响；图6是游离AGRO100适配体对AGRO100-GS纳米粒子细胞内化的抑制效应；图7是游离TDO适配体对AGRO100-GS纳米粒子细胞内化的抑制效应；图8是琼脂糖凝胶电泳检测纳米粒子对siRNA分子的包裹能力；图9是琼脂糖凝胶电泳检测纳米粒子上共价连接的siRNA分子；图10是AGRO100/siRNA-GS纳米粒子介导的在A549和成纤维细胞中的RNA干扰；图11是不同浓度条件下纳米粒子对荧光素酶基因表达的RNA干扰。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步的说明，以下所述，仅是对本专利技术的较佳实施例而已，并非对本专利技术做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的
技术实现思路
加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本专利技术方案内容，依据本专利技术的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本专利技术的保护范围内。本专利技术以明胶硅氧烷(GS)纳米粒子为载体，我们通过二硫键将AGRO100适配体和siRNA同时连接到GS纳米粒子表面。通细胞仪和激光共聚焦显微镜检测了纳米粒子的细胞靶向性；通过对A549细胞中荧光素酶表达量的检测，我们初步评估了该纳米粒子介导的RNA干扰的效率。AGRO100/siRNA-GS纳米粒子的制备具体包括以下步骤：步骤一、AGRO100-GS纳米粒子的合成向20mLpH＝3.0的盐酸溶液中加入0.15g的明胶，配制成0.75％的明胶溶液。向明胶溶液中加入0.2gGPSM，60℃的条件恒温搅拌30mi本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种核仁素靶向的明胶/硅氧烷‑siRNA纳米复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤；1)向盐酸溶液中加入明胶配制成明胶溶液，向明胶溶液中加入GPSM，60℃的条件恒温搅拌30min，然后向反应体系中加入APTMS，继续搅拌8‑9小时，将得到的悬浮液离心超声洗涤三次后即可得到GS纳米粒子；2)将巯基化试剂Traut’s reagent加入悬液中振荡反应12小时，随后超声离心得到巯基化的GS纳米粒子；3)将得到的GS离心弃去上清，将GS超声重悬于含有Na3PO4、NaCl、pH＝7.2的溶液中配成浓度为5mg/ml的悬浊液，将SPDP用DMSO溶解，配成20mM的浓度，将SPDP溶液加入GS悬液中振荡反应1小时；4)将GS‑SPDP离心12min后弃去上清液，将GS‑SPDP重悬于含有Na3PO4、NaCl、EDTA、pH＝7.2的溶液中，浓度为2mg/ml，将用同样溶液溶解的适配体分子加入悬浊液中，振荡反应12小时后离心收集适配体‑GS纳米粒子，将纳米粒子在PBS中反复超声重悬离心2次以洗去非共价吸附在GS表面的适配体分子；5)将巯基化的正义链连接到GS上，再将反义链加入反应体系中退火形成双链结构。...
【技术特征摘要】
1.一种核仁素靶向的明胶/硅氧烷-siRNA纳米复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤；1)向盐酸溶液中加入明胶配制成明胶溶液，向明胶溶液中加入GPSM，60℃的条件恒温搅拌30min，然后向反应体系中加入APTMS，继续搅拌8-9小时，将得到的悬浮液离心超声洗涤三次后即可得到GS纳米粒子；2)将巯基化试剂Traut’sreagent加入悬液中振荡反应12小时，随后超声离心得到巯基化的GS纳米粒子；3)将得到的GS离心弃去上清，将GS超声重悬于含有Na3PO4、NaCl、pH＝7.2的溶液中配成浓度为5mg/ml的悬浊液，将SPDP用DMSO溶解，配成20mM的浓度，将SPDP溶液加入GS悬液中振荡反应1小时；4)将GS-SPDP离心12min后弃去上清液，将GS-SPDP重悬于含有Na3PO4、NaCl、EDTA、pH＝7.2的溶液中，浓度为2mg/ml，将用同样溶液溶解的适配体分子加入悬浊液中，振荡反应12小时后离心收集适配体-GS纳米粒子，将纳米粒子在PBS中反复超声重悬离心2次以洗去非共价吸附在GS表面的适配体分子；5)将巯基化的正义链连接到GS上，再将反义链加入...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵雪芹，任磊，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。