一种检测脑膜炎和脑炎的装置和方法制造方法及图纸

本发明专利技术涉及一种使用多重巢式PCR检测脑膜炎和脑炎的试剂盒，所述试剂盒包括第一片层和第二片层；第一片层和第二片层之间的泡；顶表面连接至所述片层的储存器；其位于第一片层和第二片层之间的孔；连接所述泡、储存器和孔的通道；荧光染料；和用于检测以下一种或多种微生物的PCR引物；其中所述试剂盒在加入样品后处于密封状态。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及检测脑膜炎和脑炎的装置和方法，具体地说涉及一种使用多重巢式PCR检测脑膜炎和脑炎的装置和方法。
技术介绍
中枢神经系统(CNS)感染是造成脑和/或脑周边脑膜组织的炎症症状(即脑膜炎、脑炎、脑膜脑炎，本文中统称为ME)的原因。感染性ME可由多种病原体引起，其中包括细菌、病毒、真菌和原生动物。在美国，细菌性脑膜炎的病例已减少，由1998-1999年的每100,000人群中2例减少到2006-2007的每100,000中1.38例，主要是由于引入了流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、脑膜炎双球菌的疫苗。然而，这些感染的发病率和致死率仍然很高。约15％的病例是致死的，而许多其它病例导致终生残疾，例如肢缺损、视听缺陷、癫痫和学习和记忆能力的改变。病毒性脑膜炎(也称为无菌性脑膜炎)和病毒性脑膜炎更加普遍，已导致美国1988-1999年期间每年约有55000人住院治疗。与这些住院治疗有关的医疗费用每年高于6亿5千万美元。尽管许多病毒性中枢神经系统感染有自限性，一些病毒在缺乏有效的抗病毒治疗时仍然有致命性(例如单纯性疱疹病毒脑炎的致死率高于70％)，它们的感染会随后导致生理和认知缺陷。早期有效的ME治疗对于减少发病率和致死率非常关键，然而，由于目前诊断方法实施的困难和耗时，确定感染的病原学原因依然是一个重大的挑战。这些病原体时常会有不易察觉的临床表现，脑脊液化学和细胞学检测可能无法显示出诊断异常，尤其在感染的早期和某些人群中(如新生儿)。培养是鉴别脑脊液细菌的标准方法，它需要24-48小时的周转时间(TAT)，良好操作也需要专门技能。尽管病毒培养仍然在一些机构中操作，PCR仍然是从脑脊液中鉴别病毒的标准方法。目前在美国有两项美国食品药品管理局(FDA)批准的分子检测(用于检测肠病毒的CepheidEV和用于检测1型和2型疱疹病毒的CepheidEV)。各种其它病毒通过开放系统的实验室研发的PCR实验检测，但这些实验在技术上很复杂而且很容易感染。病毒PCR的运行周期为小于24小时至2周不等，取决于该实验在室内进行或被送往标准参考实验室。病毒PCR检测在不同设备中也存在误差。除了改善患者的结局，在ME中更加及时地鉴别病原体还有几项其他的好处：●由于快速鉴别ME病原体，抗菌的管理工作将得到改进。由于细菌脑膜炎的性质严重，一旦发现疑似细菌，经常采用广谱抗感染的经验抗菌疗法。不恰当或不充分的治疗将导致发病率和致死率，以及严重后遗症的增加，以及耐药性的提升。●快速诊断辅助感染控制实施。飞沫预防措施，包括隔离或病人的集中放置，以阻止脑膜炎双球菌的传播。更早地鉴别脑膜炎将使得适当的感染控制措施得以更快实施。此外，更早地鉴别将提供更及时的社区爆发的通知。●额外诊断检测和住院治疗时间的减少会导致费用的节省。多项研究证明了费用的节省，住院时长的减少以及更少地接受不必要的抗生素的治疗，这与脑脊液中病原体(尤其是肠病毒)的早期鉴别的分子检测相关联。(在Nolte等，Clin.Infect.Dis.43，1463-1467(2006)中记载)在最近几年中，聚合酶链反应(PCR)已经变成一种用于快速诊断传染原的选择性方法。PCR是一种诊断传染病的快速、灵敏且特殊的工具。利用PCR作为诊断的主要方法的挑战是在某些病理标本中存在各种可能的病原微生物和低水平的微生物。运行大量的PCR化验时常是不恰实际的，如果对于各种可能的病原微生物各进行一次PCR化验，其大多数预计是阴性的。当致病菌核酸的浓度很低时，问题更严重，并且需要大量样本以收集足够的反应模板。在某些情况下可能没有足够的样本针对所有可能的病原体进行化验。一种解决方法是运行多重PCR，其中样本在单个反应中同时针对多个目标进行检测。虽然已经证明多重PCR在某些系统中是有价值的，但是存在的相关缺点是高水平多重反应的稳定性和对于多个产物进行明确分析的困难。为解决这些问题，可进行巢式PCR，在第一阶段产物中嵌套第二阶段反应以提高稳定性和特异性。然而，现有方法和仪器进行第二阶段所需的实验操作需要熟练的技术人员，可能耗费大量金钱、时间和人工，并且可能导致污染或其它问题。因此，需要一种多重、快速、灵敏而特异的对ME的分子诊断方法，这对于公众健康和医疗的整体改善有巨大的潜力。
技术实现思路
本专利技术提供了一种使用多重巢式PCR检测脑膜炎和脑炎的装置，即基于平台的、用于检测脑膜炎和脑炎的试剂盒。平台结合了自动样品制备、核酸提取和基于PCR的多个独立目标检测，可从单一未处理样本进行，并在一小时内完成。它结合了巢式PCR和多重PCR(在此称为多重巢式PCR)以及DNA熔解曲线分析，以同时检测和区分多种病原体。因为样本操作和反应在一个封闭的试剂盒内进行，实验室污染的风险较低。在本专利技术的一个方面，提供了一种用于检测脑膜炎和/或脑炎的试剂盒，所述试剂盒包括：外表面的第一片层和第二片层；一个或多个泡(blister)，其位于第一片层和第二片层之间；一个或多个储存器(reservior)，其顶表面连接至所述片层；一个或多个孔(well)，其位于第一片层和第二片层之间并与所述泡和/或储存器流体连通；连接所述泡、储存器和孔的通道，所述通道使得试剂盒的液体可在泡、储存器和孔之间流动；荧光染料，所述荧光染料可与dsDNA结合而产生荧光信号，从而可产生探针/靶标双链体的解链曲线；和用于检测一种或多种脑膜炎和/或脑炎微生物的第二阶段多重PCR引物；其中所述试剂盒在加入样品后处于密封状态。在本专利技术的一个方面，本专利技术试剂盒中所述泡之一中包括选自以下的一种或多种：瓷珠、二氧化硅磁珠和第一阶段多重PCR引物。在本专利技术的一个方面，本专利技术试剂盒中所述瓷珠位于泡522中，和/或冻干颗粒形式的所述二氧化硅磁珠位于泡546中，和/或冻干颗粒形式的所述第一阶段多重PCR引物位于泡564中。在本专利技术的一个方面，本专利技术试剂盒中用于检测不同微生物的所述第二阶段PCR引物分别位于不同的所述孔中。在本专利技术的一个方面，本专利技术试剂盒的第二阶段PCR引物用于检测选自以下的一种或多种微生物：大肠杆菌K1、流感嗜血杆菌、单核细胞增多性李斯特菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、巨细胞病毒(CMV)、肠病毒(EV)、EB病毒、单纯疱疹病毒1(HSV-1)、单纯疱疹病毒2(HSV-2)、人疱疹病毒6(HHV-6)、人副肠孤病毒(HPeV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、新型隐球菌/格特隐球菌。在本专利技术的一个方面，本专利技术试剂盒中所述第二阶段多重PCR引物各自具有多个重复，每个重复位于不相邻的孔中。在本专利技术的一个方面，相邻的孔中检测的微生物具有不同的解链曲线。在本专利技术的一个方面，本专利技术试剂盒中所述储存器中分别包括选自以下的一种或多种：对照、洗涤缓冲液、核酸洗脱缓冲液、逆转录/第一阶段PCR主混合物、稀释缓冲液、第二阶段PCR预混合物。附图概述图1描述了本专利技术的试剂盒。其中，图1A描述了试剂盒的外观，其中在左侧注入口注入了模拟样品，在右侧注入口注入了水合液。图1B描述了试剂盒的泡，和泡之间热密封收口的通道。试剂盒中的储存器与片层(以及其间的泡和通道等)通常相互成直角；此处为清楚起见已被平坦化。图1C显示了泡、通道和孔阵列的功能区的示意图。图2是将试剂盒装入仪本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测脑膜炎和/或脑炎的试剂盒，所述试剂盒包括：外表面的第一片层和第二片层；一个或多个泡，其位于第一片层和第二片层之间；一个或多个储存器，其顶表面连接至所述片层；一个或多个孔，其位于第一片层和第二片层之间并与所述泡和/或储存器流体连通；连接所述泡、储存器和孔的通道，所述通道使得试剂盒的液体可在泡、储存器和孔之间流动；荧光染料，所述荧光染料可与dsDNA结合而产生荧光信号，从而可产生探针/靶标双链体的解链曲线；和用于检测一种或多种膜炎和/或脑炎微生物的第二阶段多重PCR引物；其中所述试剂盒在加入样品后处于密封状态。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测脑膜炎和/或脑炎的试剂盒，所述试剂盒包括：外表面的第一片层和第二片层；一个或多个泡，其位于第一片层和第二片层之间；一个或多个储存器，其顶表面连接至所述片层；一个或多个孔，其位于第一片层和第二片层之间并与所述泡和/或储存器流体连通；连接所述泡、储存器和孔的通道，所述通道使得试剂盒的液体可在泡、储存器和孔之间流动；荧光染料，所述荧光染料可与dsDNA结合而产生荧光信号，从而可产生探针/靶标双链体的解链曲线；和用于检测一种或多种膜炎和/或脑炎微生物的第二阶段多重PCR引物；其中所述试剂盒在加入样品后处于密封状态。2.权利要求1的试剂盒，其中所述泡之一中包括选自以下的一种或多种：瓷珠、二氧化硅磁珠和第一阶段多重PCR引物。3.权利要求2的试剂盒，其中所述瓷珠位于泡522中，和/或冻干颗粒形式的所述二氧化硅磁珠位于泡546中，和/或冻干颗粒形式的...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨星，A赫默特，M沃恩，J克劳德，M罗加切瓦，
申请(专利权)人：拜奥法尔诊断有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国;US