药物相关的转基因表达制造技术

本发明专利技术提供了核酸、载体、宿主细胞、方法和组合物以给予和/或提高细胞免疫治疗介导的免疫应答，如通过过继转移CD8+中枢记忆T细胞或中枢记忆T细胞与遗传修饰以在诱导型启动子的控制下表达嵌合受体的CD4+T细胞组合。在某些供选择的方案中，遗传修饰的宿主细胞包括核酸，所述核酸包括在诱导型启动子控制下的编码包括配体结合域的嵌合抗原受体的多核苷酸、包括间隔区的多核苷酸、包括跨膜域的多核苷酸和包括胞内信号传导域的多核苷酸。控制嵌合受体的表达提供了根据患者的状态使表达打开和关闭的能力。还描述了通过所述方法产生的药物制剂和使用所述药物制剂的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求2014年10月2日提交的美国临时专利申请号62/058,973、2014年4月10日提交的美国临时专利申请号61/977,751、2014年4月30日提交的美国临时专利申请号61/986,479、2014年12月9日提交的美国临时专利申请号62/089,730、2014年12月11日提交的美国临时专利申请号62/090845和2014年12月5日提交的美国临时专利申请号62/088,363的优先权的权益。上述申请的全部公开内容特别地通过引用全文并入。序列表、表格或计算机程序列表的引用本专利技术连同电子格式的序列表一起提交。序列表提供为2015年4月7日创建的大小为65kb的命名为SCRI-53WO_SEQUENCE_LISTING.TXT的文件。信息是电子格式的序列表通过引用全文并入本文。
技术介绍
通过转基因表达对表达于肿瘤细胞上的表面分子特异的嵌合抗原受体(CAR)工程化的人T淋巴细胞的过继转移具有有效地治疗癌症的潜能。嵌合受体是包括胞外配体结合域的合成受体，最常见的是连接于胞内信号传导组分的单克隆抗体的单链可变区片段(scFv)，最常见的是单独的CD3ζ或CD3ζ与一个或多个共刺激域的组合。在设计嵌合受体中的许多研究集中于限定scFv和靶向于恶性细胞而对必要的正常组织没有导致严重毒性的其他配体结合元件，以及集中于限定胞内信号传导组件的优化组合以激活T细胞效应功能。虽然，证明了T细胞(CAR-T)过继治疗临床试验(表达嵌合抗原受体的T细胞)强有力的抗肿瘤活性，明显的是显著的毒性可以出现，例如，移植诱导的细胞因子风暴、肿瘤溶解综合征和持续的B细胞减少，其中的每一个可以归因于组成性表达的CAR的不受调控的功能性输出。这样的毒性在一些情况下可以威胁限制CAR-T细胞过继治疗的应用。使用转基因修饰的过继T细胞免疫治疗的临床试验仅测试了组成性表达转基因或一直处于“开”状态的T细胞，其大部分贡献了转基因关联的副作用。CAR-T细胞的自杀基因介导的清除可以减轻这样的毒性；然而，该方法有使抗肿瘤活性提早衰减的风险并显著影响治愈潜能。当前的小分子调控的转基因表达技术依赖于包括大环内酯类、蜕化素和雷帕霉素类似物多种药物输入。由于毒性脱靶效应、不利的生物分布和药效动力学谱、有限的输出动态范围和/或作为FDA批准的商业可得的药物的有限的可用性，这些系统的临床应用性是有限的。此外，许多这些系统使用嵌合的由异源基因组分建立的转录调控因子，因此当这些系统应用于人的治疗时，引入免疫原性的并发症。存在鉴别用于确定嵌合受体设计的元件的方法的需求，所述嵌合受体设计的元件对治疗活性和细胞群进行基因修饰和过继转移是重要的，所述过继转移会提供提高的存活和在体内的疗效，同时使不良的副作用最小化。还存在用于调节用于细胞治疗的细胞的表达系统和方法，如用于调节重组抗原受体如CAR和/或这样的细胞表达的其他分子的需求，以例如改善治疗活性，提高存活和/或在体内的疗效，和/或使不利的副作用最小化。
技术实现思路
本公开的一个方面包括在细胞中递送药物调控的转基因表达的遗传系统。在替代的实施方式中，调控的转基因表达靶向于细胞，如设计用于过继免疫治疗的淋巴细胞。该系统提供了归因于嵌合抗原受体(CAR)重新定向的过继免疫策略而不牺牲允许在体内对CAR表达实时临床医师控制的治愈性目的严格安全性。基于临床医师开的显示临床上允许的药代动力学、组织分布和在淋巴细胞的胞外空间与细胞溶胶之间的分配的制药药物输入，通过工程化使药物能够响应性转录控制CAR表达的载体，CAR的活性和其他细胞介质可以在体内转换“开”和“关”。遗传系统提供药物调控的转基因表达以在药物不存在下执行功能性的“关”状态，以及在药物存在下执行功能性“开”状态的转基因表达。这样的药物的一种替代是他莫昔芬。他莫昔芬是一种雌激素拮抗剂/部分激动剂，是FDA批准并且商业可获得的药物。他莫昔芬是口服的并且可以在较长一段时间内每天施用。他莫昔芬具有经证实的安全性记录、有利的药代动力学谱、优秀的组织分布和胞外空间与细胞溶胶之间的低分配系数。可以基于安全性记录、有利的药代动力学谱、优秀的组织分布、胞外空间与细胞溶胶之间的低分配系数和/或低毒性选择其他药物。在一些供选择的方案中，在他莫昔芬的存在下系统采用合成的转录调控因子，结合转基因上游的合成启动子以诱导表达。他莫昔芬调控的转录因子(“TamR-tf”，也指“HEA3”)是由人亚单位组成的嵌合转录因子，所述人亚单位包括肝细胞核因子1-α(HNF-1α)的N-末端DNA结合域，HNF-1α的N-末端DNA结合域框内融合(fusedinframe)于雌激素受体配体结合域(ER-LBD)的突变的他莫昔芬特异性配体结合域，所述突变的他莫昔芬特异性配体结合域反过来融合于NF-κB(p65)的p65激活域。在表10中提供了示例性的氨基酸序列，并且鉴别为SEQIDNO:40。雌激素受体配体结合域(ER-LBD)的突变的他莫昔芬特异性配体结合域在TamR-tf的第282-595位氨基酸处发现，并且在第521位具有突变。NF-κB(p65)的p65激活域在SEQIDNO:40的第596-862位氨基酸处发现。对转录激活因子可以做出进一步的改变以增加转录因子的特性，包括但不限于在雌激素受体配体结合域中改变一个或多个氨基酸以增加用于雌激素类似物的因子的亲和性，以及在p65反式激活域中改变一个或多个氨基酸。在他莫昔芬不存在下，通过细胞溶胶的热休克蛋白90(HSP90)与他莫昔芬结合活性位点的结合将TamR-tf排除在细胞核外，并且转基因表达处于“关”状态。纳摩尔浓度的细胞溶胶他莫昔芬积极地与HSP90竞争ER-LBD结合，导致TamR-tf移位至细胞核。在细胞核移位时，TamR-tf可容易地用于结合其限制的合成启动子(如7xHBD/EF1αp)。在他莫昔芬存在下，TamR-tf与7xHBD/EF1αp启动子的结合诱导转基因表达的“开”状态。在一些供选择的方案中，可以修饰该转录调控因子以提供变化水平的转基因表达的控制。TamR-tf的LBD中的氨基酸置换允许对他莫昔芬和其代谢物选择性应答，其中4-羟基他莫昔芬(4-OHT)是关于TamR-tf活性的药理学上的活性代谢物，同时缺少与内源性雌激素的相互作用。一方面，本公开涉及给予和/或增强由细胞免疫治疗，如由过继转移肿瘤特异性的、遗传修饰的单独或组合的CD8+或CD4+T细胞亚集介导的免疫应答的方法和组合物。本公开提供了嵌合受体核酸，和包括这样的核酸的载体和宿主细胞。编码嵌合受体的核酸序列与许多可以切除并用其他组分替换的模块化组分连接在一起以定制用于效应T细胞激活和识别特异性靶分子或在靶分子上的表位的嵌合受体，并提供如本文描述的调控的转录。在一些供选择的方案中，用于诱导型表达嵌合抗原受体的系统包括：第一核酸，包括可通过药物诱导的第一启动子，其中第一核酸可操作地连接于编码包括配体结合域的嵌合抗原受体的多核苷酸，其中配体结合域对配体是特异性的，其中配体是肿瘤特异性分子、病毒分子或任意其他表达于靶细胞群上的分子，其中配体可以引起由淋巴细胞进行的识别、调节、抑制和/或消除；编码多肽间隔区的多核苷酸，其本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于嵌合抗原受体的诱导型表达的系统，包括：a)第一核酸，包括可通过药物诱导的第一启动子，其中，所述第一核酸可操作地连接于编码包括配体结合域的嵌合抗原受体的多核苷酸，其中，所述配体结合域对配体是特异性的，其中，所述配体是肿瘤特异性分子、病毒分子或任意其他表达于靶细胞群上的分子，其中，所述配体可以引起由淋巴细胞进行的识别、调节、抑制和/或消除；编码多肽间隔区的多核苷酸，其中，所述间隔区是优化的；编码跨膜域的多核苷酸；和d)编码胞内信号传导域的多核苷酸；和b)第二核酸，包括第二启动子，所述第二启动子可操作地连接于编码用于诱导型启动子的转录激活因子的核酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.04.10 US 61/977,751;2014.04.30 US 61/986,479;1.一种用于嵌合抗原受体的诱导型表达的系统，包括：a)第一核酸，包括可通过药物诱导的第一启动子，其中，所述第一核酸可操作地连接于编码包括配体结合域的嵌合抗原受体的多核苷酸，其中，所述配体结合域对配体是特异性的，其中，所述配体是肿瘤特异性分子、病毒分子或任意其他表达于靶细胞群上的分子，其中，所述配体可以引起由淋巴细胞进行的识别、调节、抑制和/或消除；编码多肽间隔区的多核苷酸，其中，所述间隔区是优化的；编码跨膜域的多核苷酸；和d)编码胞内信号传导域的多核苷酸；和b)第二核酸，包括第二启动子，所述第二启动子可操作地连接于编码用于诱导型启动子的转录激活因子的核酸。2.权利要求1所述的系统，其中，所述药物是他莫昔芬和/或他莫昔芬的代谢物。3.权利要求2所述的系统，其中，所述第一启动子包括SEQIDNO：41的核酸序列。4.权利要求1-3中任一项所述的系统，其中，所述第二启动子是组成型启动子。5.权利要求4所述的系统，其中，所述第二启动子是EF1αp。6.权利要求1-5中任一项所述的系统，其中，所述转录激活因子包括SEQIDNO：40的序列。7.权利要求1-6中任一项所述的系统，其中，所述第一核酸进一步包括第一载体并且所述第二核酸进一步包括第二载体。8.权利要求7所述的系统，其中，两种载体均被包装在病毒载体中。9.权利要求8所述的系统，其中，所述病毒载体是慢病毒。10.权利要求1-6中任一项所述的系统，其中，所述第一核酸和所述第二核酸包括载体。11.权利要求1-10中任一项所述的系统，其中，所述第一核酸进一步包括编码选择性标记的核酸序列。12.权利要求1-11中任一项所述的系统，其中，所述第二核酸进一步包括编码选择性标记的核酸。13.一种用于嵌合抗原受体的诱导型表达的系统，包括：a)第一核酸，包括可通过药物诱导的第一启动子，其中，所述第一核酸可操作地连接于编码细胞因子、趋化因子受体、调控细胞凋亡的多肽或调节检查点信号传导的多肽的多核苷酸；和b)第二核酸，包括第二启动子，所述第二启动子可操作地连接于编码用于诱导型启动子的转录激活因子的核酸。14.权利要求1-13中任一项所述的系统，其中，所述第二核酸进一步包括编码包括配体结合域的嵌合抗原受体的多核苷酸，其中，所述配体是肿瘤特异性分子、病毒分子或任意其他表达于靶细胞群上的分子，其中，所述配体可以引起由淋巴细胞进行的识别、调节、抑制和/或消除；编码多肽间隔区的多核苷酸，其中，所述间隔区是优化的；编码跨膜域的多核苷酸；和d)编码胞内信号传导域的多核苷酸。15.权利要求1-14中任一项所述的系统，其中，所述第一启动子在所述第二启动子的相对取向。16.权利要求1-15中任一项所述的系统，其中，所述配体结合域是抗体片段。17.权利要求16所述的系统，其中，所述配体结合域是单链可变区片段。18.权利要求1-17中任一项所述的系统，其中，所述肿瘤特异性分子选自由CD19、CD20、CD22、CD23、CD123、CS-1、ROR1、CE7、EGFR、hB7H3、间皮素、c-Met、PSMA、Her2、GD-2、MAGEA3TCR和其组合组成的组。19.一种由权利要求1-18或34-38中任一项所述的系统的第一核酸和/或第二核酸编码的嵌合受体多肽。20.一种宿主细胞，包括权利要求1-18或34-38中任一项所述的系统。21.权利要求20所述的宿主细胞，其中，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：迈克尔·C·延森，
申请(专利权)人：西雅图儿童医院DBA西雅图儿童研究所，
类型：发明
国别省市：美国;US