细菌菌蜕的补料分批生产方法技术

本发明专利技术涉及基于断开裂解基因表达和细菌细胞的实际裂解的联系的细菌菌蜕的补料分批生产方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利技术描述本专利技术涉及基于断开裂解基因表达和细菌细胞实际裂解联系的细菌菌蜕补料分批生产方法.细菌菌蜕平台系统是用于医疗应用的具有前景的新技术.从革兰氏阴性细菌得来，细菌菌蜕是具有持久的细胞形态的空的细菌细胞被膜。细菌菌蜕通过受控的裂解基因异源表达从活菌产生，例如，噬菌体φX174裂解基因E.编码出的蛋白E是靶向细胞分裂位点，在该处寡聚并诱导内外膜的融合的短(91个氨基酸)非酶促膜相关蛋白(Witteetal.，1990.J.Bacteriol.，172(7)：4109-4114).这最终导致了密封周质空间的不同的跨膜隧道结构的形成.由细胞质和周围介质之间的渗透压差驱动，具有其所有成分的细胞质被排出到介质中，留下空细菌菌蜕.使用细菌菌蜕作为灭活疫苗或佐剂的用途，以及在其细胞被膜结构中携带异源蛋白的重组细菌菌蜕制品在WO91/13555和WO93/01791中公开，其通过引用并入本文。如WO00/53163中所述的，细菌菌蜕进一步适合作为活性化合物的载体或靶向载体.细菌菌蜕应用的广谱性迫切需求经济、有力和可扩展的其制备方法.常规细菌菌蜕生产方法是以分批模式进行的。复合培养基中的低密度分批方法已经被描述在Langemannetal.，2010Bioengineeredbugs，1(5)：326-336中.目前大肠杆菌菌蜕的生产以修改自DeLisaetal.，1999Biotechnol.Bioeng.，65(1)：54-64.的在确定成分培养基中的中密度分批方法来实现.在该方法中(裂解诱导前约5g/l的生物量干细胞重量(DCW))，可以达到1010个细胞/ml培养肉汤的最终浓度。E-裂解效率超过99.8％.希望提供使用高密度分批处理方法的更有效的生产细菌菌蜕方法.但先前的这种类型的方法已被证明有问题.在高细胞密度，大量的细胞质成分被排出到培养基中急剧改变培养肉汤的特性.这将导致严重的问题如增加的粘度、起泡、降低的氧传递和坏物质传递。本专利技术的目的是提供一种生产细菌菌蜕制品的方法，其中以前的方法的缺点已被克服.该目的是通过使用基于导致高总裂解效率的断开裂解基因表达和实际细胞裂解过程的联系的高细胞密度培养方法来实现的.因此，本专利技术的第一个方面涉及生产细菌菌蜕制品的方法，包括下列步骤：(a)提供包含编码能够在细菌细胞被膜中形成隧道结构的蛋白的裂解基因的细菌细胞，(b)在其中所述裂解基因不被表达的条件下培养细菌细胞，(c)在步骤(b)后，使所述细菌细胞经受裂解基因被表达但是细菌细胞裂解被抑制的条件，(d)在步骤(c)后，使所述细菌细胞经受其中发生所述细菌细胞的裂解的条件，和(e)获得所得的细菌菌蜕.在步骤(a)中提供的细菌细胞可以是来自适合细菌菌蜕生产的任何类型的细菌，例如，革兰氏阴性细菌细胞，尤其是大肠杆菌(例如，在EP-A-0291021和EP-A-0516655中公开的，其通过引用并入本文)，鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、肺炎杆菌、支气管炎博德特菌、幽门螺杆菌、霍乱弧菌、胸膜肺炎放线杆菌、流感嗜血杆菌、溶血曼海姆菌、多杀性巴氏杆菌、绿脓杆菌、恶臭假单胞菌、真氧产碱杆菌或果胶杆菌.细菌细胞包括编码能够在细菌被膜中形成隧道结构的蛋白质(裂解蛋白)的裂解基因.该裂解基因可以是任何适当类型的裂解基因，例如基因E，优选噬菌体ΦX174裂解基因E(Henrichetal.，1982Mol.Gen.Genet.，185(3)493-497)，包括其天然产生的或重组变体.裂解基因是染色体外的或被整合到细菌细胞的基因组中.在步骤(b)中，细菌细胞在裂解基因不被表达的条件下培养.为了这个目的，裂解基因优选地被置于可调控启动子的可操作控制下，例如，化学或温度可调控启动子。可以使用不同的化学可调控启动子/操纵子系统，以通过加入能诱导启动子可操作控制下的基因表达的化合物来控制裂解基因的表达，包括乳糖启动子，色氨酸启动子，tet启动子，tac启动子，trc启动子或者其衍生物.诱导化合物的实例是IPTG，异丙基-D-硫代半乳糖苷，乳糖或阿拉伯糖.当裂解基因的表达在热可调控启动子的可操作控制下时，温度诱导的λPR或PL启动子或其衍生物可以被使用，任选地与修饰的操纵子序列和温度敏感性c1857阻遏子组合(例如如WO98/07874中所述，在此通过引用并入)，例如λpL/λpR-c1857系统.热可调控启动子可通过调节温度到容许表达温度来进行诱导.容许表达温度是由达到诱导裂解基因表达的必要温度所确定的.本专利技术中，优选使用的热可调控启动子在约30℃-37℃下被抑制，并且通过温度升高到约40-50℃，优选约42-45℃一段时间，例如大约至少10分钟能被诱导.在本专利技术的优选的方面，用于生产细菌菌蜕的细菌细胞的培养按补料分批方法，即，按培养过程中一种或多种营养物被提供给生物反应器，并且其中细胞保留在生物反应器中直至培养结束的培养方法来进行.在进一步优选的方面，在步骤(b)中，细菌细胞被培养至最终生物量浓度约10-100gDCW/L，优选约20-80gDCW/L，更优选约30-70gDCW/L，最优选约40-60gDCW/L培养基.在步骤(c)中，细菌细胞经受裂解基因被表达但细菌细胞的裂解被抑制的条件。裂解基因表达可通过诱导如上所述的可调控启动子来触发.为断开裂解基因表达和蛋白裂解过程的联系，已经发现当细菌细胞保持在至少基本上稳定的状态，例如伪稳定或稳定状态时裂解过程可以被抑制.可替代地，裂解过程也可以通过低于6或高于8的pH值来抑制(Lubitzetal.，1984J.Gen.Microbiol.，130(5)，1079-1087).在优选的实施方案中，细菌细胞的裂解是通过特定底物摄取速率qs的调整来控制.特定底物摄取速率qs(以g/gh计的单位时间消耗底物量)以底物体积摄取速率rs(以g/lh计的单位时间消耗底物量)和物量浓度X(干细胞重g/l)的比率根据公式1来确定.公式1：以g/gh计的特定底物摄取速率的确定.根据本专利技术，特定底物速率qs令人惊讶地被确定为控制细菌细胞的裂解的关键参数。特定底物速率qs是影响细胞生理，特别是在裂解基因表达阶段和随后的裂解过程中可量化可控制的工艺参数.因此，裂解蛋白的裂解功能与细菌细胞有裂解能力的生理状态，例如允许细菌细胞进行裂解的生理状态有关.因此，有可能通过将培养转换到细菌细胞的无裂解能力的生理状态来表达裂解基因而不裂解细胞.因此，在步骤(b)中，生产细菌菌蜕的细菌细胞的培养优选在至少约0.4g/gh，优选至少约0.5g/gh，更优选至少约0.6g/gh，最优选至少约0.7g/gh的特定底物的摄取速率qs下进行.接着，在步骤(c)中，通过转换细胞至低的特定底物摄取速率qs的状态，特别是其中特定底物的摄取速率qs为约0.1-0.3g/gh，更特别为0.2-0.25g/gh可以获得至少基本上稳定的状态。在步骤(d)中，其中细菌细胞经受其中细菌细胞的裂解发生的条件.裂解过程的开始可以通过将培养复位到细菌细胞有裂解能力的生理状态，例如到其中的特定底物摄取速率qs高的状态来触发.因此，细菌细胞的裂解可以通过提供生长刺激来诱导，特别是通过提供营养物到培养基中，更特别通过提本文档来自技高网...

【技术保护点】
生产细菌菌蜕制品的方法，包括以下步骤：(a)提供包含编码能够在细菌细胞被膜中形成隧道结构的蛋白的裂解基因的细菌细胞，(b)在其中所述裂解基因不被表达的条件下培养细菌细胞，(c)在步骤(b)后，使所述细菌细胞经受裂解基因被表达但是细菌细胞裂解被抑制的条件.(d)在步骤(c)后，使所述细菌细胞经受其中发生所述细菌细胞的裂解的条件，和(e)获得所得的细菌菌蜕.

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.02.21 US 61/942,6951.生产细菌菌蜕制品的方法，包括以下步骤：(a)提供包含编码能够在细菌细胞被膜中形成隧道结构的蛋白的裂解基因的细菌细胞，(b)在其中所述裂解基因不被表达的条件下培养细菌细胞，(c)在步骤(b)后，使所述细菌细胞经受裂解基因被表达但是细菌细胞裂解被抑制的条件.(d)在步骤(c)后，使所述细菌细胞经受其中发生所述细菌细胞的裂解的条件，和(e)获得所得的细菌菌蜕.2.根据权利要求1的方法，其中细菌细胞是革兰氏阴性细菌细胞，特别是大肠杆菌细胞.3.根据权利要求1-2任一项的方法，其中编码裂解蛋白的裂解基因是噬菌体ΦX174裂解基因E.4.根据权利要求1-3任一项的方法，其中编码裂解蛋白的裂解基因的表达是受可调控启动子的可操作控制，例如化学或热可调控启动子.5.根据权利要求4的方法，其中化学可调控的启动子是乳糖启动子或色氨酸启动子.6.根据权利要求4的方法，其中热可调控的启动子是λc1857启动子.7.根据权利要求1-6任一项的方法，其中细菌细胞的培养以补料分批培养方式进行.8.根据权利要求1-7任一项的方法，其中细菌细胞的培养进行到最终生物量浓度为约10-80g干细胞重(DCW)/L，优选约20-70gDCW/L，更优选约30-60gDCW/L，最优选约40-50gDCW/L培养基.9.根据权利要求1-8任一项的方法，其中步骤(b)包括在至少约0.4g/gh的特定底物摄取速率qs下培养细菌细胞(以g/gh计的单位时间消耗底物量).10.根据权利要求1-9任一项的方法，其中在步骤(c)中，使所述细菌细胞处于至少基本上稳定的状态，特别是其中特定底物摄取速率qs为约0.1-0.3g/gh的状态.11.根据权利要求1-10任一项的方法，其中步骤(c)包括诱导所述可调控的启动子，例如通过加入诱导化学化合物和/或通过调节温度到容许表达温度.12.根据权利要求1-11任一项的方法，其中在步骤(d)中，通过提...

【专利技术属性】
技术研发人员：W·卢比茨，C·赫维希，T·朗格曼，P·扎格迈斯特，
申请(专利权)人：比得C有限责任两合公司，
类型：发明
国别省市：奥地利;AT