用于识别复杂样品中微量目标组分的细胞膜色谱柱及其制备方法及目标组分的识别鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种用于识别复杂样品中微量目标组分的细胞膜色谱柱及其制备方法及目标组分的识别鉴定方法，其中用于识别复杂样品中微量目标组分的细胞膜色谱柱(简称识别柱)中填充有表达特定受体的细胞膜色谱固定相，可以提高复杂样品中“目标组分”筛选的特异性，对提高筛选效率、阐明作用机理具有重要的意义。该识别鉴定方法通过识别柱对复杂样品中“目标组分”进行特异性识别，并通过富集柱对微量“目标组分”进行在线富集，进一步由高效液相色谱质谱进行分离鉴定。该方法具有高效识别、在线富集复杂样品中微量“目标组分”的特性，能够提升分析效率，提高分析灵敏度，实现对复杂样品中“目标组分”的高效率筛选。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞膜色谱
，涉及一种用于识别、鉴定复杂样品中微量“目标组分”的细胞膜色谱柱及利用该细胞膜色谱柱识别、鉴定复杂样品中微量“目标组分”的方法。
技术介绍
复杂样品(如中药提取物及其制剂)中组分复杂(上百种)，高通量筛选是发现复杂体系中目标组分的重要方法，已报道有许多的高通量筛选方法，例如直接基于受体或酶的筛选，计算机辅助药物设计的虚拟筛选等。传统的利用高效液相色谱分析方法对复杂样品进行指纹图谱分析，很难对其中的所有组分进行指认。且有以下局限性：(1)效率低下，无法有效判定“目标组分”；(2)分析时间长，复杂样品组分众多，色谱分析时间普遍在60min以上，有机溶剂消耗量较大；(3)分离度差，复杂样品中各组分难以达到基线分离，微量“目标组分”容易被常量组分所“掩埋”，而无法测得。细胞膜色谱(cellmembranechromatography,CMC)是一种仿生亲和色谱技术。细胞膜色谱不仅具有色谱的分离能力，同时兼具有生物活性，已经证明细胞膜色谱技术是一种有效的从复杂体系中筛选目标组分的新方法。20世纪90年代以来，高效液相色谱质谱联用(HPLC/MS)已广泛的应用于识别和鉴定复杂的样品，多级质谱已广泛的应用于中药中目标组分的分离鉴定。二维液相色谱的不断发展进步，通过两个不同分离过程或机理对复杂样品进行分离，能够提高峰容量，降低色谱峰的重叠，显著改善分离分析结果。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于识别复杂样品中微量目标组分的细胞膜色谱柱及其制备方法及目标组分的识别鉴定方法，该细胞膜色谱柱中填充有表达特定受体的细胞膜色谱固定相，具有高效识别复杂样品中微量“目标组分”的特性，能够实现对复杂样品中微量“目标组分”的高效率筛选。为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种用于识别复杂样品中微量目标组分的细胞膜色谱柱，该细胞膜色谱柱中填充有表达特定受体的细胞膜色谱固定相，即吸附有表达特定受体的细胞膜的硅胶，其中特定受体为能够与被筛选的目标组分特异性结合的受体。用于识别复杂样品中微量目标组分的细胞膜色谱柱的制备方法，包括以下步骤：1)制备细胞膜混悬液将培养好的表达特定受体的细胞离心、清洗，然后使用裂解液在冰浴条件下将表达特定受体的细胞破碎，除去细胞器，取上清液，加入生理盐水混匀，制得细胞膜混悬液；其中表达特定受体的细胞为其细胞膜上表达能够与被筛选的目标组分特异性结合的受体的细胞；2)制备表达特定受体的细胞膜色谱固定相将硅胶活化后置于具支试管中，冰浴条件下，向具支试管中加入细胞膜混悬液，涡旋振荡，然后静置，使硅胶吸附细胞膜混悬液中的细胞膜，得到表达特定受体的细胞膜色谱固定相；3)细胞膜色谱固定相湿法装柱用装柱机将表达特定受体的细胞膜色谱固定相进行湿法装柱，得到用于识别复杂样品中微量目标组分的细胞膜色谱柱。所述步骤1)具体为：取培养好的表达特定受体的细胞的混悬液，在4℃下离心，离心后倒掉上清液，取底层细胞；将底层细胞用生理盐水清洗并吹打均匀放入EP管中，在4℃下离心；向离心好的细胞中加入Tris-Hcl，在冰浴条件下超声破碎，再用细胞破碎仪破碎，然后离心，除去细胞器，取上清液；将上清液配平，然后离心，离心后细胞膜贴在EP管壁上，加入生理盐水吹散并混合均匀，得到细胞膜混悬液。所述步骤2)具体为：将经纯化过的硅胶放于烘箱中烘烤活化，将活化好的硅胶装入具支试管中，再将具支试管放在冰中，在涡旋状态下用注射器把细胞膜混悬液加入具支试管中，涡旋振荡；然后将具支试管中的混合物倒入烧杯中，放入经三蒸水洗过的磁子，4℃下磁力搅拌，搅拌完成后取出磁子，在4℃冰箱中放置过夜，使硅胶吸附细胞膜，然后加入生理盐水进行离心，洗去未接合在硅胶上的细胞膜，得到表达特定受体的细胞膜色谱固定相。所述步骤3)具体为：将装柱机用三蒸水洗干净，装柱的柱套是不锈钢开口柱，把柱芯放入柱套中，不带筛板的一端柱芯朝上，将表达特定受体的细胞膜色谱固定相倒入装柱机中，沿壁加三蒸水至溢出，然后加盖扭紧，开泵向其中注入流动相，流动相的流速为1.0mL/min，从滴第一滴水开始计时，9min后停泵，即得到用于识别复杂样品中微量目标组分的细胞膜色谱柱。一种利用用于识别复杂样品中微量目标组分的细胞膜色谱柱对复杂样品中微量目标组分进行识别鉴定的方法，包括以下步骤：1)仪器组装将用于识别复杂样品中微量目标组分的细胞膜色谱柱装入液相色谱仪中，在液相色谱仪的检测出口处安装一个十通阀，十通阀上连接两个富集柱，十通阀的出口通向高效液相色谱仪和质谱仪；2)目标组分的识别鉴定待用于识别复杂样品中微量目标组分的细胞膜色谱柱充分平衡后，对待分析的复杂样品进样分析，若有组分在细胞膜上保留，则该组分即为目标组分，目标组分先在富集柱中进行富集，随后切换到高效液相色谱仪中进行分离，再进入质谱仪中进行鉴定。相对于现有技术，本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的用于识别复杂样品中微量目标组分的细胞膜色谱柱(简称识别柱)，是在细胞膜色谱柱中填充有表达特定受体的细胞膜色谱固定相，其中表达特定受体的细胞膜色谱固定相即为吸附有表达特定受体的细胞膜的硅胶，特定受体为能够与被筛选的目标组分特异性结合的受体。识别柱中填充的表达特定受体的细胞膜色谱固定相可以提高复杂样品中“目标组分”筛选的特异性，能够针对复杂样品中的“目标组分”进行特异性的识别，提升分析效率，对提高筛选效率、阐明作用机理具有重要的意义。本专利技术提供的用于识别复杂样品中微量目标组分的细胞膜色谱柱的制备方法，先将培养的表达特定受体的细胞离心、清洗，使用裂解液在冰浴条件下将细胞破碎，加入生理盐水混匀，制得细胞膜混悬液；然后将硅胶活化后置于具支试管中，冰浴条件下加入细胞膜混悬液，涡旋振荡，静置后湿法装柱，即得到识别柱；该方法步骤简单，操作方便，利用硅胶吸附细胞膜形成细胞膜色谱固定相，再进行湿法装柱即可，能够方便、快捷的制得能够对复杂样品中的“目标组分”进行特异性识别的识别柱。本专利技术提供的利用用于识别复杂样品中微量目标组分的细胞膜色谱柱对复杂样品中微量目标组分进行识别鉴定的方法，将识别柱装入液相色谱仪中，在液相色谱仪的检测出口处安装一个十通阀，十通阀上连接两个富集柱，十通阀的出口通向高效液相色谱仪和质谱仪；对待分析的复杂样品进样分析，若有组分在细胞膜上保留，则该组分即为目标组分，目标组分先在富集柱中进行富集，随后切换到高效液相色谱仪中进行分离，再进入质谱仪中进行鉴定。其中识别柱针对复杂样品中的“目标组分”进行特异性的识别，提升分析效率；富集柱对微量的“目标组分”具有富集作用，提高分析灵敏度。该方法比传统高效液相色谱法有明显的优点，该方法通过识别柱对复杂样品中“目标组分”进行特异性识别，并通过富集柱对微量“目标组分”进行在线富集，再进一步由高效液相色谱质谱进行分离鉴定，具有高效识别、在线富集复杂样品中微量“目标组分”的特性，能够提升分析效率，提高分析灵敏度，实现对复杂样品中“目标组分”的高效率筛选，该方法在复杂样品的分析中具有重要意义。附图说明图1为用本专利技术的HMC-1/CMC-HPLC/MS方法分析丹参注射液的色谱行为图；其中(A)为用HMC-1/CMC模型分析丹参注射液,R0为不保留部分，R1，R2为两个保留部分；(B)为混合标准在H本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于识别复杂样品中微量目标组分的细胞膜色谱柱，其特征在于：该细胞膜色谱柱中填充有表达特定受体的细胞膜色谱固定相，即吸附有表达特定受体的细胞膜的硅胶，其中特定受体为能够与被筛选的目标组分特异性结合的受体。

【技术特征摘要】
1.一种用于识别复杂样品中微量目标组分的细胞膜色谱柱，其特征在于：该细胞膜色谱柱中填充有表达特定受体的细胞膜色谱固定相，即吸附有表达特定受体的细胞膜的硅胶，其中特定受体为能够与被筛选的目标组分特异性结合的受体。2.权利要求1所述的用于识别复杂样品中微量目标组分的细胞膜色谱柱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)制备细胞膜混悬液将培养好的表达特定受体的细胞离心、清洗，然后使用裂解液在冰浴条件下将表达特定受体的细胞破碎，除去细胞器，取上清液，加入生理盐水混匀，制得细胞膜混悬液；其中表达特定受体的细胞为其细胞膜上表达能够与被筛选的目标组分特异性结合的受体的细胞；2)制备表达特定受体的细胞膜色谱固定相将硅胶活化后置于具支试管中，冰浴条件下，向具支试管中加入细胞膜混悬液，涡旋振荡，然后静置，使硅胶吸附细胞膜混悬液中的细胞膜，得到表达特定受体的细胞膜色谱固定相；3)细胞膜色谱固定相湿法装柱用装柱机将表达特定受体的细胞膜色谱固定相进行湿法装柱，得到用于识别复杂样品中微量目标组分的细胞膜色谱柱。3.根据权利要求2所述的用于识别复杂样品中微量目标组分的细胞膜色谱柱的制备方法，其特征在于，所述步骤1)具体为：取培养好的表达特定受体的细胞的混悬液，在4℃下离心，离心后倒掉上清液，取底层细胞；将底层细胞用生理盐水清洗并吹打均匀放入EP管中，在4℃下离心；向离心好的细胞中加入Tris-Hcl，在冰浴条件下超声破碎，再用细胞破碎仪破碎，然后离心，除去细胞器，取上清液；将上清液配平，然后离心，离心后细胞膜贴在EP管壁上，加入生理盐水吹散并混合均匀，得到细胞膜混悬液。4.据权利要求2所述的用于识别复杂样品中微量目标组分的细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺浪冲，孙萌，林园园，韩省力，马维娜，吕艳妮，杨柳，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61