本发明专利技术百草枯的免疫胶体金检测卡及其制备方法，涉及动物源食品兽药残留检测技术领域。本发明专利技术的检测卡外壳中的试纸条，由PVC胶板、样品垫、胶体金结合垫、包被膜和吸水垫组成；胶体金膜为含百草枯单克隆抗体的玻璃纤维素膜，包被膜是硝酸纤维素膜，其上设有T线和C线，T线包被有百草枯蛋白质偶联物，C线包被有羊抗鼠IgG抗体。本发明专利技术有效用于快速检测百草枯，方便、快捷、结果准确。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及谷物食品中农药残留检测
，特别是涉及百草枯的免疫胶体金检测卡及其制备方法。
技术介绍
百草枯，化学名称是1-1-二甲基-4-4-联吡啶阳离子盐，是一种快速灭生性除草剂，具有触杀作用和一定内吸作用。能迅速被植物绿色组织吸收，使其枯死。对非绿色组织没有作用。在土壤中迅速与土壤结合而钝化，对植物根部及多年生地下茎及宿根无效。但百草枯对人毒性极大，且无特效解毒药，口服中毒死亡率可达90%以上，目前已被20多个国家禁止或者严格限制使用。我国自2014年7月1日起，撤销百草枯水剂登记和生产许可、停止生产；但保留母药生产企业水剂出口境外使用登记、允许专供出口生产，2016年7月1日停止水剂在国内销售和使用。因此定期对百草枯残留进行检测成为许多国家的监控的必要手段。现有技术对于百草枯的检测主要是气相色谱-质谱法、高效液相色谱法等检测方法，但这些技术的缺陷明显：设备昂贵、操作复杂、难以推广。所以，建立一种简单、有效、适合基层使用的测定方法是极其必要的。本专利技术的目的是研制一种更适合企业进行现场检测且快捷简便、成本低廉的定性检测方法。
技术实现思路
针对以上情况，本专利技术的目的就是为了克服现有技术存在的缺陷而提供一种百草枯的免疫胶体金检测卡及其制备方法，可有效解决能快速、简便地检测出百草枯的问题。本专利技术的百草枯胶体金检测卡，包括包被了单克隆抗体胶体金标记物的胶体金结合垫、包被了百草枯-BSA和羊抗鼠IgG的硝酸纤维素膜、样品垫、吸水垫、PVC胶板和塑料模具组成，在PVC胶板的一端依次粘附样品垫、结合垫，中间黏贴硝酸纤维素膜，另一端粘附吸水垫。本专利技术的百草枯胶体金检测卡的制备方法，是由以下步骤实现：(1)胶体金溶液制备：取1L三角烧瓶1个，加入超纯水495mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl4·3H2O)5mL，配制成500mL0.01%氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)溶液5-7mL，继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8℃保存备用；(2)抗体的预处理：将要标记的百草枯抗体在1000r/min,4℃条件下，离心20min，取上清，用0.01mol/LPBS稀释成1mg/mL；或者用0.01mol/LPBS稀释成1mg/ml，过0.22µm滤膜；(3)胶体金标记物的制备：取步骤(1)中的胶体金溶液40mL，用0.25mol/LK2CO3调节胶体金溶液pH至8.5，电磁搅拌器250r/min搅拌，逐滴加入4mL含0.3mg抗体蛋白的蛋白溶液，反应10min；逐滴加入4mL10%BSA，继续搅拌反应10min；金标抗体溶液常温低速（1500r/min）离心10min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4℃，12000r/min离心20min，弃上清，收集沉淀，将沉淀用金标抗体稀释液定容至1mL，制备成百草枯单克隆抗体胶体金标记物；(4)胶体金膜的制备：将步骤(3)百草枯蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物用划膜仪以5µL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，室温自然晾干或者37℃烘干3h，制成含百草枯蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物的胶体金膜；(5)包被膜制备：将羊抗鼠IgG抗体、百草枯蛋白质偶联物稀释成1mg/mL，用划膜仪依次以1µL/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，制备成包被膜，37℃包被2h后，室温自然晾干或者37℃烘干；(6)样品垫前处理：将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在空气湿度低于60%的条件下，室温自然晾干；(7)检测卡的组装：PVC胶板自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水棉，组装成试纸条，切割成一定宽度的长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。所述步骤(5)中所包被的检测线T设在质控线C的下方；所述步骤(6)中的样品垫处理液是由1g小牛血清蛋白(BSA)和0.8g氯化钠(NaCl)，用含有0.5%TRITON-100的0.01mol/LPBS定容至100mL；本专利技术可有效用于测定百草枯，方法简单，方便、快捷，结果准确。附图说明图1为本专利技术百草枯的免疫胶体金检测卡的结构图：图中1.加样孔2.检测线3.质控线4.检测孔5.试纸条6.检测卡外壳。图2为本专利技术百草枯的免疫胶体金检测卡内的试纸条的剖视结构图，图中7.样品垫8.胶体金结合垫9.PVC胶板10.硝酸纤维素膜11.吸水垫。具体实施方式实施例1图1、图2所示的实施例：图中9为PVC胶板；7为样品垫；8为胶体金结合垫，该胶体金结合垫上包被了单克隆抗体胶体金标记物；10为包被膜，即硝酸纤维素膜，该硝酸纤维素膜上包被了百草枯-BSA和羊抗鼠IgG；11为吸水垫，由吸水材料如滤纸制成。在PVC胶板9的一端上(样品端)粘附样品垫7、结合垫8，样品垫7和结合垫8为并排结构。在PVC胶板9的中间粘附硝酸纤维素膜10。在硝酸纤维素膜10上设置有羊抗鼠IgG质控线3和百草枯-BSA检测线2。在PVC胶板9的另一端粘附吸水垫11。硝酸纤维素膜10的一端与结合垫8略交叉，另一端与吸水垫11略交叉。该试纸条5可装入有塑料模具制成的检测卡外壳6中，制成检测卡，在检测卡外壳6的上盖上设有加样孔1和检测孔4，样品垫7正对加样孔1，硝酸纤维素膜10正对检测孔4。实施例2百草枯胶体金检测卡制备，是由以下步骤具体实现：胶体金溶液制备：取1L三角烧瓶1个，加入超纯水495mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl4·3H2O)5mL，配制成500mL0.01%氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)溶液5-7mL，继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8℃保存备用；抗体的预处理：将要标记的百草枯抗体在1000r/min,4℃条件下，离心20min，取上清，用0.01mol/LPBS稀释成1mg/mL；或者用0.01mol/LPBS稀释成1mg/ml，过0.22µm滤膜；胶体金标记物的制备：取步骤(1)中的胶体金溶液40mL，用0.25mol/LK2CO3调节胶体金溶液pH至8.5，电磁搅拌器250r/min搅拌，逐滴加入4mL含0.3mg抗体蛋白的蛋白溶液，反应10min；逐滴加入4mL10%BSA，继续搅拌反应10min；金标抗体溶液常温低速（1500r/min）离心10min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4℃，12000r/min离心20min，弃上清，收集沉淀，将沉淀用金标抗体稀释液定容至1mL，制备成百草枯单克隆抗体胶体金标记物；胶体金膜的制备：将步骤(3)百草枯蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物用划膜仪以5µL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，室温自然晾干或者37℃烘干3h，制成含百草枯蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物的胶体金膜；包被膜制备：将羊抗鼠IgG抗体、百草枯蛋白质偶联物稀释成1mg/mL，用划膜仪依次以1µL/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，制备成包被膜，37℃包被2h后，室温自然晾干或者37℃烘干；样品垫前处理本文档来自技高网...
【技术保护点】
百草枯胶体金检测卡，其特征在于按照下述步骤制备得到：(1)胶体金溶液制备：取1 L 三角烧瓶1个，加入超纯水495 mL，而后加入1%氯金酸HAuCl4·3H2O)5 mL，配制成500 mL 0.01%氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠Na3C6H5O7·2H2O溶液5‑7 mL，继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5 min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2‑8℃保存备用；(2)抗体的预处理：将要标记的百草枯抗体在1000 r/min，4℃条件下，离心20 min，取上清，用0.01 mol/L PBS稀释成1 mg/mL；或者用0.01 mol/L PBS稀释成1 mg/ml，过0.22 µm滤膜；(3)胶体金标记物的制备：取步骤(1)中的胶体金溶液40 mL，用0.25 mol/L K2CO3调节胶体金溶液pH至 8.5，电磁搅拌器250 r/min搅拌，逐滴加入4 mL 含0.3 mg 抗体蛋白的蛋白溶液，反应10 min；逐滴加入4 mL 10% BSA，继续搅拌反应10 min；金标抗体溶液常温1500 r/min离心10 min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4℃，12000 r/min 离心20 min，弃上清，收集沉淀，将沉淀用金标抗体稀释液定容至1 mL，制备成百草枯单克隆抗体胶体金标记物；(4)胶体金膜的制备：将步骤(3)百草枯蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物用划膜仪以5 µL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，室温自然晾干或者37℃烘干3 h，制成含百草枯蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物的胶体金膜；(5)包被膜制备：将羊抗鼠IgG抗体、百草枯蛋白质偶联物稀释成1 mg/mL，用划膜仪依次以1 µL/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，制备成包被膜，37℃包被2 h后，室温自然晾干或者37℃烘干；(6)样品垫前处理：将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在空气湿度低于60%的条件下，室温自然晾干；(7)检测卡的组装：PVC胶板自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水棉，组装成试纸条，切割成一定宽度的长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。...
【技术特征摘要】
1.百草枯胶体金检测卡，其特征在于按照下述步骤制备得到：(1)胶体金溶液制备：取1L三角烧瓶1个，加入超纯水495mL，而后加入1%氯金酸HAuCl4·3H2O)5mL，配制成500mL0.01%氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠Na3C6H5O7·2H2O溶液5-7mL，继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8℃保存备用；(2)抗体的预处理：将要标记的百草枯抗体在1000r/min，4℃条件下，离心20min，取上清，用0.01mol/LPBS稀释成1mg/mL；或者用0.01mol/LPBS稀释成1mg/ml，过0.22µm滤膜；(3)胶体金标记物的制备：取步骤(1)中的胶体金溶液40mL，用0.25mol/LK2CO3调节胶体金溶液pH至8.5，电磁搅拌器250r/min搅拌，逐滴加入4mL含0.3mg抗体蛋白的蛋白溶液，反应10min；逐滴加入4mL10%BSA，继续搅拌反应10min；金标抗体溶液常温1500r/min离心10min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4℃，12000r/min离心20min...
【专利技术属性】
技术研发人员：洪霞，杜霞，刘静，
申请(专利权)人：江苏维赛科技生物发展有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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