5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的提取方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种5‑O‑[4′‑O‑(β‑D‑吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的提取方法：忍冬藤药材粉碎及提取，大孔吸附树脂柱、凝胶柱、半制备HPLC依次分离纯化。所得对照品1H‑NMR图谱中未观察到杂质氢信号；经HPLC纯度检查，不同色谱柱和流动相测定结果表明均为一个主色谱峰；以峰面积归一化法测定含量大于98％。本发明专利技术方法操作简便，步骤简单；有机溶剂用量少，所有试剂均可回收利用，分离成本低。产品纯度高，可作为对照品使用，用于相关中药材、中成药的活性及质量控制研究。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于中药及天然药物成分提取和纯化
，涉及一种中药忍冬藤中5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的提取方法，还涉及提取得到的5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的应用。
技术介绍
中药忍冬藤为忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥茎枝。味甘，性寒，具有清热解毒，疏风通络的功效，用于温病发热，热毒血痢，痈肿疮疡，风湿热痹，关节红肿热痛。其化学成分主要包括有机酸类、三萜类、环烯醚萜类、黄酮类、挥发油类等。5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸，该化合物结构式如下：研究发现，该成分为忍冬藤的主要成分之一，其含量甚至超过了药典控制的绿原酸的含量，有必要对其进行质量控制。但由于缺少高纯度的对照品，对5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的研究仅限于定性分析，对该成分的活性、质量控制研究较少。因此，制备5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的对照品，就成为一项迫切的工作。
技术实现思路
为了解决以上现有技术中无5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸对照品的问题，本申请提供了一种5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的提取方法。本专利技术还提供了5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸在作为对照品中的应用。本专利技术是通过以下步骤得到的：本专利技术所提供的一种5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的制备方法，包括以下步骤：(1)将忍冬藤药材粉碎，加4～10倍量体积分数为30～70％(优选50～60％)的甲醇或乙醇溶液，超声提取(功率500W，频率40kHZ)2～3次，每次0.5～1小时，合并提取液并滤过，减压回收提取溶剂(水浴加热温度不超过60℃)至干，得到干浸膏a，其中目标成分质量分数约为1％～2％；(2)取步骤(1)获得的干浸膏a，加1～2倍量水(优选1倍量水)使溶解，以大孔吸附树脂柱进行纯化(柱填料用量为干浸膏重量的1～2倍，优选1.5～2倍)，以水为洗脱溶剂，洗脱3～4个柱体积，收集洗脱液并合并，减压回收溶剂(水浴加热温度不超过60℃)至干得干浸膏b，干浸膏b中目标成分质量分数约为8％～10％；(3)取步骤(2)获得的干浸膏b，加等量水使溶解，以凝胶柱进行纯化(柱体积为样品水溶液体积的10～20倍，优选10～15倍)，以水为洗脱溶剂，洗脱3～4个柱体积，以30～40分之一柱体积作为一份收集洗脱液。以HPLC进行检测，合并含有目标成分的洗脱液，减压回收溶剂(水浴温度不超过60℃)至干。以凝胶柱反复纯化2～4次，干浸膏中目标成分质量分数可达65～70％；(4)以半制备HPLC继续纯化，收集含有目标成分的洗脱液，收集液经浓缩干燥即得，以HPLC峰面积归一化法测定，目标成分含量大于98％。上述步骤(1)中忍冬藤药材选自忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥茎枝。上述步骤(2)中所述大孔吸附树脂为非极性或弱极性大孔吸附树脂，优选型号为D101或AB-8型大孔吸附树脂。上述步骤(3)中所述凝胶为葡聚糖凝胶或羟丙基葡聚糖凝胶，优选型号为SephadexG-25或SephadexLH-20型凝胶。上述步骤(3)和(4)中HPLC条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈-0.1～1％冰醋酸溶液(体积比3～10:97～90)或甲醇-0.1～1％冰醋酸溶液(体积比6～20:94～80)；检测波长为327nm。得到的5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸作为质量控制对照品。本专利技术制备的化合物单体成分经HR-ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC、1H-1HCOSY等技术鉴定为5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸。1H-NMR图谱中未观察到杂质氢信号；经HPLC纯度检查，不同色谱柱和流动相测定结果表明均为一个主色谱峰；以峰面积归一化法测定含量大于98％，符合含量测定用中药化学对照品的要求。有益效果：1)本专利技术的5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的提取方法，提取率高，得到的产品纯度高，可作为对照品使用，用于相关中药材、中成药的活性及质量控制研究；2)本专利技术方法操作简便，步骤简单；有机溶剂用量少，所有试剂均可回收利用，分离成本低。附图说明图1为实施例1制备的5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的HR-ESI-MS图谱，图2为实施例1制备的5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的1H-NMR图谱，图3为实施例1制备的5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的13C-NMR图谱，图4为实施例1制备的5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的HSQC图谱，图5为实施例1制备的5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的HMBC图谱，图6为实施例1制备的5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的1H-1HCOSY图谱，图7为实施例1制备的5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的HPLC条件A纯度检查色谱图，图8为实施例1制备的5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的HPLC条件B纯度检查色谱图，图9为实施例1制备的5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的HPLC条件C纯度检查色谱图。具体实施方式以下通过具体实施例对本专利技术作进一步的说明，并非对本专利技术的限定，依照本领域公知的现有技术，本专利技术的实施方式并不限于具体实施例。实施例1一、化合物提取分离(1)取忍冬藤药材500g，粉碎成粗粉，加8倍量体积分数为50％的甲醇溶液，超声提取(功率500W，频率40kHZ)2次，每次0.5小时，合并提取液并滤过，以旋转蒸发仪回收提取溶剂(水浴加热温度55℃)至干，得干浸膏a；(2)干浸膏a加等量水使溶解，以D101大孔吸附树脂柱进行纯化(柱填料用量为干浸膏重量的2倍)，以水为洗脱溶剂，洗脱3个柱体积，收集洗脱液并合并，以旋转蒸发仪回收溶剂(水浴加热温度55℃)至干得干浸膏b；(3)干浸膏b加等量水使溶解，以SephadexLH-20凝胶柱进行纯化(柱体积为样品水溶液体积的15倍)，以水为洗脱溶剂，洗脱3个柱体积，以40分之一柱体积作为一份收集洗脱液，以HPLC进行检测，合并含有目标成分的洗脱液，以旋转蒸发仪回收溶剂(水浴温度55℃)至干，以SephadexLH-20凝胶柱反复纯化2次，得到干浸膏c；(4)干浸膏c加适量水使溶解，微孔滤膜(0.45μm)滤过，经半制备HPLC纯化，色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为乙腈-0.4％冰醋酸溶液(体积比4:96)，327nm检测，收集含有目标成分的洗脱液，收集液经浓缩干燥后可得5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸(产率0.50％，提取率67.7％)。二、化合物结构鉴定白色无定形粉末，易溶于水。HR-ESI-MS图谱(附图1)给出准分子离子峰m/z本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种5‑O‑[4′‑O‑(β‑D‑吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的提取方法，其特征在于包括以下步骤：(1)将忍冬藤药材粉碎，加4～10倍质量体积分数为30～70％的甲醇或乙醇溶液，超声功率500W，频率40kHz提取2～3次，每次0.5～1小时，合并提取液并滤过，减压回收提取溶剂至干，得到干浸膏a；(2)取干浸膏a，加1～2倍质量的水溶解，以大孔吸附树脂柱进行纯化，柱填料用量为干浸膏重量的1～2倍，以水为洗脱溶剂，洗脱3～4个柱体积，收集洗脱液并合并，减压回收溶剂至干，得到干浸膏b；(3)取干浸膏b，加等质量水使溶解得水溶液，以凝胶柱进行纯化，柱体积为水溶液体积的10～20倍，以水为洗脱溶剂，洗脱3～4个柱体积，以30～40分之一柱体积作为一份收集洗脱液，以HPLC进行检测，合并含有目标成分的洗脱液，减压回收溶剂至干，以凝胶柱反复纯化2～4次，得干浸膏c；(4)以半制备HPLC继续纯化，收集含有目标成分的洗脱液，收集液经浓缩干燥即得，5‑O‑[4′‑O‑(β‑D‑吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸含量大于98％。

【技术特征摘要】
1.一种5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的提取方法，其特征在于包括以下步骤：(1)将忍冬藤药材粉碎，加4～10倍质量体积分数为30～70％的甲醇或乙醇溶液，超声功率500W，频率40kHz提取2～3次，每次0.5～1小时，合并提取液并滤过，减压回收提取溶剂至干，得到干浸膏a；(2)取干浸膏a，加1～2倍质量的水溶解，以大孔吸附树脂柱进行纯化，柱填料用量为干浸膏重量的1～2倍，以水为洗脱溶剂，洗脱3～4个柱体积，收集洗脱液并合并，减压回收溶剂至干，得到干浸膏b；(3)取干浸膏b，加等质量水使溶解得水溶液，以凝胶柱进行纯化，柱体积为水溶液体积的10～20倍，以水为洗脱溶剂，洗脱3～4个柱体积，以30～40分之一柱体积作为一份收集洗脱液，以HPLC进行检测，合并含有目标成分的洗脱液，减压回收溶剂至干，以凝胶柱反复纯化2～4次，得干浸膏c；(4)以半制备HPLC继续纯化，收集含有目标成分的洗脱液，收集液经浓缩干燥即得，5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸含量大于98％。2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于步骤(3)和(4)中HPLC条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈-0.1～1％冰醋酸溶液，两者体积比为(3～10):(97～90)...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭东晓，林永强，徐丽华，焦阳，崔伟亮，
申请(专利权)人：山东省食品药品检验研究院，
类型：发明
国别省市：山东;37