提取河豚鱼毒素的方法技术

本发明专利技术公开了一种提取河豚鱼毒素（ＴＴＸ）的方法，涉及一种由动物材料提取的物质，主要解决提高ＴＴＸ的提取得率等技术问题，相应采用的技术方案是，将河豚鱼内脏切碎、磨浆、压滤、加热去蛋白和油脂，再进行连续过滤，得纯清液，将上述纯清液浓缩上色谱柱、洗脱结晶，得ＴＴＸ纯品，本发明专利技术的方法适用于提取河豚鱼内脏的ＴＴＸ。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种由动物材料提取的物质，特别是由河豚鱼。
技术介绍
河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX)是一种海洋生物毒素，存在于河豚鱼、蝾螈、法螺、蟹、章鱼等体内，目前主要来源还是河豚鱼的内脏，TTX的分子式C11H17O8N3，分子量319。剧毒，小白鼠的LD10μg/kg。TTX由于在极微量的情况下就能阻断细胞钠离子的通道，而对钾离子通道没有影响，具有高度的专一性，因此是十分有用的神经生理研究用工具药。临床医学上已证明TTX是良好的镇静剂、解痉剂、镇痛剂，特别对癌症等恶性疼痛具有良好的镇痛作用，与传统的杜冷丁、吗啡等镇痛药相比虽然响应时间稍长，但其镇痛作用可达12-20小时，而且无成瘾性。近来TTX在戒毒方面也显示出良好的效果，一般戒毒者只需每日注射30μgTTX一针，5-7天为一个疗程，毒瘾即可得到控制，并可大大减轻一般戒毒中常常出现的戒毒综合症。TTX目前主要从河豚鱼的内脏中提取，由于TTX在河豚鱼中含量极低，不到1ppm，对其分离和提纯十分困难，以往的提取工艺十分复杂，要通过几十道工序才能得到TTX的晶体，不仅消耗大量的人力、物力，也容易造成环境的污染。传统的TTX提取工艺包括有下列步骤新鲜的河豚鱼内脏加福尔马林—切碎—加水—加温—冷却沉淀—分离得清液—加温—去油层—清液加碱—沉淀—分离—沉淀物加酸上活性炭柱脱色—滤液加碱—沉淀—得TTX粗品—加酸溶解—上色谱柱—洗脱—加碱沉淀结晶—加酸溶解—过滤—加碱结晶—分离—干燥—得TTX纯品。上述过程，除了工艺复杂意外，其中相转换损失、高温对TTX的破坏、活性炭吸附等因素，均使TTX的提取得率大大降低，因而成为这一
进步的一大障碍。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题，是提供一种改进的提取河豚鱼毒素的方法，它能提高TTX的提取得率，简化提取工艺，并能减少废弃物对环境的污染。解决上述技术问题采用的步骤包括有首先将新鲜的河豚鱼内脏切碎、磨浆、压滤、加热去蛋白和油脂，得浓缩清液；进行连续过滤，分别按下列次序进行将上述的浓缩清液在过滤膜孔径为1μm至5μm的过滤器中进行过滤，得新清液；将上述的新清液在过滤膜孔径为0.1μm至0.8μm的过滤器中进行过滤，得澄清液，再将上述的澄清液，在过滤膜孔径为1nm至5nm的过滤器中进行过滤，得纯清液；将上述的纯清液浓缩上色谱柱、洗脱结晶，得TTX纯品。本专利技术采用连续过滤程序，使其提取工艺程序简化，有利规模生产；免除传统工艺中的相反应，减少相转换损失，不采用高温，避免高温破坏TTX，不再用活性炭(或其它吸附剂)吸附，这些因素均使本专利技术的方法可大大提高提取得率；同时，其相应的污染物也明显减少，有利环境保护。4.将上述的纯清液浓缩，得浓缩纯清液，即上液相色谱柱，用醋酸作洗脱液洗脱，用氨水调节PH8.0～10.0，温度8℃至12℃，静置20～30小时，结晶沉淀，将结晶用水洗涤，然后冷却干燥，得纯度大于99％的TTX纯晶。为进一步说明本专利技术的提取方法，下面以10kg新鲜河豚鱼内脏提取TTX为例，其相应提取步骤如下1、将10Kg新鲜的河豚鱼卵巢用绞肉机绞碎后用球磨机磨成肉浆。2、将上述肉浆加水10Kg，用搅拌机搅拌30分钟，然后用板框压滤机压滤，压滤所得滤液储存备用；滤饼加入10Kg水后用搅拌机搅拌30分钟，再经压滤分离。然后再重复一次。将三次所得滤液混合备用。3、将上述滤液放入带搅拌的夹套反应锅中，搅拌转速每分钟20转。加热至沸10分钟。然后静置、冷却，将反应锅中滤液通过15μm过滤膜除去热固性蛋白，得清液。4、将上述清液减压蒸馏，温度60℃-70℃，真空度350mm汞柱，时间60分钟，然后静置分层，将上层油脂除去，得浓缩清液。5、将浓缩清液先通过3μm过滤膜，得新清液，然后通过0.25μm过滤膜过滤，得澄清液，将上述澄清液通过5nm的过滤膜，得纯清液。6、将纯清液减压蒸馏，浓缩至1000ml，得浓缩纯清液，即上液相色谱柱。色谱条件如下制备型高效液相色谱仪，固定相为400*40mmLC-18，流动相为浓缩纯清液，流速5ml-50ml/min，用示差折光检测器检测，按记录仪的峰图收集馏份。分离柱为弱酸性阳离子树脂。7、用5％的醋酸洗脱，得300ml洗脱液，将洗脱液减压蒸馏得浓缩液，用氨水调节浓缩液PH至9.0，温度10℃左右，静置24小时可见白色结晶沉淀。8、过滤，将沉淀取出，用水洗涤，然后真空干燥即得河豚毒素结晶150mg，纯度为97％。若颜色偏黄，可用重结晶方式可得白色结晶纯度99％的TTX120mg，和传统提取方比较，其TTX提取率提高达35％。权利要求1.一种，其特征在于包括下列步骤a、将河豚鱼内脏切碎、磨浆、压滤、加热去蛋白和油脂，得浓缩清液；b、连续过滤，分别按下列次序进行将上述的浓缩清液在过滤膜孔径为1μm至5μm的过滤器中进行过滤，得新清液；将上述的新清液在过滤膜孔径为0.1μm至0.8μm的过滤器中进行过滤，得澄清液；将上述的澄清液，在过滤膜孔径为1nm至5nm的过滤器中进行过滤，得纯清液；c、将上述的纯清液浓缩上色谱柱、洗脱结晶，得TTX纯品。2.根据权利要求1所述的提取河豚鱼毒素的方法，其特征是上述各种孔径的过滤膜可为纤维素(CA)膜、聚砜(PA)膜、聚丙烯(PP)膜、聚四氟乙烯(PTFE)膜或尼龙膜。全文摘要本专利技术公开了一种提取河豚鱼毒素(TTX)的方法，涉及一种由动物材料提取的物质，主要解决提高TTX的提取得率等技术问题，相应采用的技术方案是，将河豚鱼内脏切碎、磨浆、压滤、加热去蛋白和油脂，再进行连续过滤，得纯清液，将上述纯清液浓缩上色谱柱、洗脱结晶，得TTX纯品，本专利技术的方法适用于提取河豚鱼内脏的TTX。文档编号C07D491/00GK1425666SQ01142658公开日2003年6月25日 申请日期2001年12月14日 优先权日2001年12月14日专利技术者梁映华 申请人:上海华腾生物工程有限公司本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提取河豚毒素的方法，其特征在于包括下列步骤：ａ、将河豚鱼内脏切碎、磨浆、压滤、加热去蛋白和油脂，得浓缩清液；ｂ、连续过滤，分别按下列次序进行：将上述的浓缩清液在过滤膜孔径为１μｍ至５μｍ的过滤器中进行过滤，得新清液；将上 述的新清液在过滤膜孔径为０．１μｍ至０．８μｍ的过滤器中进行过滤，得澄清液；将上述的澄清液，在过滤膜孔径为１ｎｍ至５ｎｍ的过滤器中进行过滤，得纯清液；ｃ、将上述的纯清液浓缩上色谱柱、洗脱结晶，得ＴＴＸ纯品。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：梁映华，
申请(专利权)人：上海华腾生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]