降钙素原抗体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种降钙素原抗体的制备方法，其包括以下步骤：步骤一，小鼠免疫，用降钙素原全长表达蛋白免疫小鼠；步骤二，细胞融合，融合前7-10天复苏小鼠骨髓瘤细胞，放入二氧化碳细胞培养箱培养；步骤三，单克隆细胞株筛选，融合细胞培养6天后吸取原有培养液，加入200µl新鲜的HAT培养基；步骤四，单克隆抗体制备。本发明专利技术可以获得特异性好、亲和力高的单克隆抗体。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种抗体的制备方法，特别是涉及一种降钙素原抗体的制备方法。
技术介绍
降钙素原（procalcitonin，PCT）是一种糖蛋白质，来自定位于第11号染色体上(11p15，4)的单拷贝基因。PCT是血清降钙素（CT）的前肽物质，PCT前体在内源多肽酶作用下剪掉nPro-CT端单一序列，生成116个氨基酸的PCT，分子量约为13kD。其分子结构为含57个氨基酸的N末端（N-ProCT）、含32个氨基酸CT（Cakitonin）和含21个氨基酸钙抑肽（Katacalcin）组成。在正常生理情况下，PCT是由甲状腺合成与分泌的，其在健康人体的血浆中的含量非常低(小于0.1ng/ml)，但是PCT蛋白在体内的稳定性很好，半衰期大约为20-24h。PCT在人体感染时受内毒素、TNF-α等细胞因子影响在多种组织均可产生，当严重细菌、脓毒症、多脏器功能衰竭时其在血浆中的水平升高，自身免疫、过敏和病毒感染时PCT不会升高，PCT反映了全身炎症反应的活跃程度。PCT已被认为是一种用于细菌感染早期诊断、鉴别诊断及治疗监控的最新特异性指标。因此，PCT的检测在临床诊断上有着重要的价值。目前，临床上对于PCT的检测主要采用免疫学的方法，包括胶体金免疫层析、酶免法、免疫荧光法、免疫化学发光、放射免疫分析法等。而采用这些方法最关键的是获得好用的PCT抗体。由于PCT在正常人血清中含量很低（<0.1ng/ml），临床上的诊断界值一般为0.5ng/ml。因此对诊断用的PCT抗体，除了特异性要好外，对亲和力要求也非常高。专利技术内容本专利技术所要解决的技术问题是提供一种降钙素原抗体的制备方法，其可以获得特异性好、亲和力高的单克隆抗体。本专利技术是通过下述技术方案来解决上述技术问题的：一种降钙素原抗体的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：步骤一，小鼠免疫，用降钙素原全长表达蛋白免疫小鼠；步骤二，细胞融合，融合前7-10天复苏小鼠骨髓瘤细胞，放入二氧化碳细胞培养箱培养；步骤三，单克隆细胞株筛选，融合细胞培养6天后吸取原有培养液，加入200μl新鲜的HAT培养基；步骤四，单克隆抗体制备。优选地，所述步骤四选用6-8周龄BLAB/c小鼠，腹腔注射0.5ml石蜡油，1周以后腹腔注射105-106/500μl的9B3细胞；用注射器收集腹水，离心取上清后用GE公司的proteinA预装柱进行纯化；最后获得纯化的降钙素原单克隆抗体。优选地，所述步骤二采用颈椎脱臼法处死4周龄BALB/c小鼠，按无菌操作取出小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞铺于96孔板。优选地，所述步骤三在第二天取培养上清，用ELISA法筛选阳性孔。优选地，所述ELISA法采用ELISA检测板，ELISA检测板制备条件：按50ng每孔的抗原量包被，包被液为碳酸盐缓冲液，封闭液为5%的脱脂奶粉；阳性孔再次更换新鲜培养基，培养1天后再次用ELISA法检测培养上清；选择2次检测都为阳性的孔进行第一次克隆化培养，即通过有限稀释使96孔板平均每个孔只含有1个细胞；7天后，对克隆化培养板细胞培养上清进行ELISA检测，选择阳性孔。本专利技术的积极进步效果在于：本专利技术获得特异性好、亲和力高的单克隆抗体。具体实施方式本专利技术为了获得特异性好、亲和力高的单克隆抗体，首先采用的免疫抗原是已经作为抗原制备过羊多抗，并获得了临床可用的多抗。因此本专利技术的抗原是验证过的抗原。另一方面，本专利技术在抗体筛选过程中加入了亲和力的筛选，确保得到的抗体具有高亲和力。通过本专利技术的方法最终获得了特异性好，亲和力高的PCT单克隆抗体9B3、2H5。应用本专利技术的PCT单克隆抗体9B3、2H5形成双抗夹心酶免法检测50例阳性临床样本结果全部为阳性，可以检测PCT含量为0.1ng/ml的临床稀释样本。本专利技术降钙素原抗体的制备方法包括以下步骤：步骤一，小鼠免疫，用PCT全长表达蛋白免疫6-8周龄BALB/c小鼠，具体免疫方案如下表1所示：表1加强免疫结束后3天，采小鼠尾血，利用ELISA法检测小鼠血清效价。经过免疫的小鼠血清效价大多在1:105-1:106左右，本专利技术选取效价高的小鼠进行下一步细胞融合。步骤二，细胞融合，融合前7-10天复苏小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，确保细胞在融合时处于对数生长期，状态良好。融合前一天取饲养细胞。采用颈椎脱臼法处死4周龄BALB/c小鼠，按无菌操作取出小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞铺于96孔板。融合当天，首先收集上述的SP2/0细胞备用。然后无菌操作解剖小鼠取脾脏，在200目的铜网上轻轻研磨获得脾细胞。将小鼠骨髓瘤细胞SP2/0与脾细胞以1：3的比例混合，离心去上清，1min内滴加1mlPEG介导融合，融合结束后以1640不完全培养基终止，最后离心去上清，加入HAT培养基重悬，100μl/孔铺入已有饲养细胞的96孔板，放入二氧化碳细胞培养箱培养。步骤三，单克隆细胞株筛选，融合细胞培养6天后吸取原有培养液，加入200μl新鲜的HAT培养基。第二天取培养上清，用ELISA法筛选阳性孔。ELISA法采用ELISA检测板，ELISA检测板制备条件：按50ng每孔的抗原量包被，包被液为碳酸盐缓冲液，封闭液为5%的脱脂奶粉；阳性孔再次更换新鲜培养基，培养1天后再次用ELISA法检测培养上清；选择2次检测都为阳性的孔进行第一次克隆化培养，即通过有限稀释使96孔板平均每个孔只含有1个细胞；7天后，对克隆化培养板细胞培养上清进行ELISA检测，选择阳性孔。将阳性孔的培养上清再进行亲和力筛选，具体方法：将抗原包被ELISA检测板，细胞培养上清先与抗原孵育1h，培养上清中的抗体会与游离抗原结合，然后将孵育后的培养上清加入到抗原包被的ELISA检测板，培养上清中未结合的游离抗体会与ELISA检测板上包被抗原结合而留在板上。最后加入酶标二抗显色，结果为阳性说明有抗体与包被抗原结合，阳性值越高说明该上清与抗原孵育后剩余的游离抗体越多，也就是相对亲和力越高。选择相对亲和力高的克隆孔继续进行克隆化，直到克隆孔检测结果100%为阳性。一般需要进行2-4次克隆化。将完成克隆化的细胞株扩大培养，最后液氮冻存。步骤四，单克隆抗体制备，选用6-8周龄BLAB/c小鼠，腹腔注射0.5ml石蜡油，1周以后腹腔注射105-106/500μl的9B3细胞，1-2周左右小鼠腹部明显膨大；用注射器收集腹水，离心取上清后用GE公司的proteinA预装柱进行纯化，纯化过程按说明书进行；最后获得纯化的PCT单克隆抗体9B3、2H5。本专利技术采用以下方式对单克隆抗体特性进行鉴定：抗体亚型：用Sigma的MonoclonalAntibodyIsotypingKitI试剂盒鉴定抗体亚型，经测定9B3、2H5抗体均属于IgG1型，Kappa轻链。抗体识别区域：分别用原核表达的PCTN末端（N-ProCT）、CT（Cakitonin）段和钙抑肽（Katacalcin）段包被ELISA，检测抗体的识别区域。结果发现2H5抗体识别位点本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种降钙素原抗体的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：步骤一，小鼠免疫，用降钙素原全长表达蛋白免疫小鼠；步骤二，细胞融合，融合前7‑10天复苏小鼠骨髓瘤细胞，放入二氧化碳细胞培养箱培养；步骤三，单克隆细胞株筛选，融合细胞培养6天后吸取原有培养液，加入200µl新鲜的HAT培养基；步骤四，单克隆抗体制备。

【技术特征摘要】
1.一种降钙素原抗体的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：
步骤一，小鼠免疫，用降钙素原全长表达蛋白免疫小鼠；
步骤二，细胞融合，融合前7-10天复苏小鼠骨髓瘤细胞，放入二氧化碳细胞培养箱培养；
步骤三，单克隆细胞株筛选，融合细胞培养6天后吸取原有培养液，加入200μl新鲜的HAT培养基；
步骤四，单克隆抗体制备。
2.如权利要求1所述的降钙素原抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤四选用6-8周龄BLAB/c小鼠，腹腔注射0.5ml石蜡油，1周以后腹腔注射105-106/500μl的9B3细胞；用注射器收集腹水，离心取上清后用GE公司的proteinA预装柱进行纯化；最后获得纯化的降钙素原单克隆抗体。
3.如权利要求1所述的降钙素原抗体的制备方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨叶民，
申请(专利权)人：上海辽岩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31