一种布美诺肽的固相合成方法技术

本发明专利技术属于多肽合成领域，具体涉及以RinkAmide Resin为固相载体，以HO-(CH2)n-COOH作为连接固相载体与目标肽的Linker，其中，羧基端通过酰胺键与固相载体相连，羟基端通过酯键与目标肽相连。该技术方案与现有技术相比，通过在固相载体及布美诺肽之间引入长链脂肪酸，大大优化了目标肽固相成环的空间环境，避免了液相方式成环时所发生的分子间偶联，最终目标肽-Linker纯度达到85％以上，纯化总收率达到50％以上，精肽纯度达到99％以上。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及多肽合成领域，特别涉及一种以长链脂肪酸做Linker进行布美诺肽固相合成的方法。
技术介绍
布美诺肽，英文名称为Bremelanotide，又称布雷默浪丹，PT141，由7个氨基酸组成，与α-促黑素细胞激素具有相同的核心序列，后者的受体在食欲及性欲唤起中起重要作用。其肽序为AC-Nle-[Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys]cycle-OH，结构式如下：性功能障碍分为男性性功能障碍及女性性功能障碍，目前用于治疗男性性功能障碍的药物多数为磷酸二酯酶5(PDE-5)抑制剂，例如西替那非，他达拉非，伐地那非。此类药物的作用机制为维持或者升高体内环腺苷酸(cAMP)的浓度，增加动脉血液流入，降低静脉血液流出，从而导致阴茎血流增加，但此类药物对女性性功能障碍不具有显著疗效。女性性反应周期是复杂的并且取决于生理，心理因素，用于女性性功能障碍的药物必须针对并且必须依赖中枢神经系统，而动物和人类的研究都已经表明布美诺肽具有明显的与局部生殖器血管充血无关的中枢神经系统效应。与其它多肽类药物相似，布美诺肽剂量少，疗效高，不会引发蓄积中毒，因此，在治疗女性性功能障碍上有广阔的市场前景。目前，布美诺肽的合成方法主要为固相合成法。专利CN200610086841.4采用逐步合成的方法，肽树脂合成结束后，选择性脱除Asp及Lys的保护基，之后在树脂上成环，最后以HF裂解，因为HF的剧烈腐蚀性而导致该方法无法大规模使用，其实施例公布的精肽收率为30～35％；专利CN200710048824.6同样采用选择性脱保护的方法，但其所选择的的脱保护方法在脱除Asp及Lys侧链保护基的同时也会脱除His的保护基，其实施例公布的粗肽收率为80％；专利CN200910131598.7布雷默浪丹的固相合成方法中将对羟基苯甲酸连接在RinkAmideResin之后，采用普通氨基酸原料逐步合成，合成结束后以TFA裂解，在液相条件下成环，但是该方法在进行液相成环时容易发生分子间偶联，产生二聚体，三聚体等多聚物，严重降低合成收率，此外，该专利在树脂与肽链间连接的对羟基苯甲酸分子较小，无法提供足够大的空间改善固相成环反应。布美诺肽是由7个氨基酸组成的环肽，其合成的技术难点在于成环。目前布美诺肽的合成技术根据成环方法可分为两类，一类是液相中成环，一类是树脂上成环。在液相中成环容易产生大量分子间偶联产物，固相成环方法又因空间位阻太大而导致成环困难。
技术实现思路
为解决布美诺肽合成的技术难点，本专利技术提供一种以长链脂肪酸做Linker进行布美诺肽固相合成的方法。具体为以RinkAmideResin为固相载体，以HO-(CH2)n-COOH作为连接固相载体与目标肽的Linker，其中，羧基端通过酰胺键与固相载体相连，羟基端通过酯键与目标肽相连。目标肽合成结束后，选择性脱除Asp及Lys的侧链保护基，在树脂上成环，环化结束后裂解，得布美诺肽-(CH2)n-NH2，碱性条件下断开酯键，得布美诺肽粗肽，经过纯化，冻干后得布美诺肽精肽。本专利技术的技术方案如下：布美诺肽的固相合成方法，包括如下步骤：(a)：RinkAmideResin与长链脂肪羟基酸HO-(CH2)n-COOH偶联合成HO-(CH2)n-CONH-RinkAmideResin；(b)：依照布美诺肽序列，在偶联剂存在条件下，依次偶联Fmoc-Lys(Mtt)-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-D-Phe-OH，Fmoc-His(Boc)-OH，Fmoc-Asp(O-2-Phipr)-OH，Fmoc-Nle-OH，Fmoc-Nle-OH，偶联完成后脱除Fmoc保护基，以乙酸酐/吡啶进行乙酰化，得AC-Nle-Asp(O-2-Phipr)-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(Mtt)-O-(CH2)n-CONH-RinkAmideResin；(c)：采用TFA/DCM溶液，选择性脱除Lys侧链保护基Mtt，Asp侧链保护基O-2-Phipr，得AC-Nle-Asp-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys-O-(CH2)n-CONH-RinkAmideResin；(d)：在偶联剂存在条件下进行树脂上环化，得：AC-Nle-[Asp-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys]cycle-O-(CH2)n-CONH-RinkAmideResin；(e)：在裂解剂存在条件下，将肽树脂裂解及侧链脱保护，得：AC-Nle-[Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys]cycle-O-(CH2)n-CONH2；(f)：以乙腈/水将AC-Nle-[Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys]cycle-O-(CH2)n-CONH2溶解，在碱性条件下酯键水解，溶液调酸后得布美诺肽粗肽；(g)：布美诺肽粗肽经过纯化，冻干，得布美诺肽精肽。其中步骤(a)中，所述长链脂肪羟基酸HO-(CH2)n-COOH为8-羟基辛酸或16-羟基十六酸，n等于7或15；RinkAmideResin的替代度为0.4～0.6mmol/g；步骤(b)和步骤(d)中缩合剂组合为DMAP/DIC/HOBT，DMAP/DIC/HOAT，DIC/HOBT，DIC/HOAT，HBTU/HOBT/DIPEA，HATU/HOAT/DIPEA中的一种；步骤(c)中TFA/DCM溶液中TFA所占体积比为3～5％；步骤(e)中，裂解试剂为加入体积比1-5％清除剂的TFA溶液，清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、巯基乙醇、苯酚、水、三异丙基硅烷中的一种或几种；步骤(f)中，乙腈/水体系中，乙腈所占的比例为5～15％，碱性条件中碱为氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化锂中的一种。优选的，一种布美诺肽的固相合成方法包括如下步骤：(a)以0.52mmol/g的RinkAmideResin为固相载体，在DIC/HOBT存在下，与HO-(CH2)7-COOH偶联，合成HO-(CH2)7-CONH-RinkAmideResin；(b)：依照布美诺肽序列，在DMAP/DIC/HOBT存在条件下，偶联Fmoc-Lys(Mtt)-OH，在DIC/HOBT存在条件下，依次偶联Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-D-Phe-OH，Fmoc-His(Boc)-OH，Fmoc-Asp(O-2-Ph本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种布美诺肽的固相合成方法，包括如下步骤：(a)：Rink Amide Resin与长链脂肪羟基酸HO‑(CH2)n‑COOH偶联合成HO‑(CH2)n‑CONH‑Rink Amide Resin；(b)：依照布美诺肽序列，在偶联剂存在条件下，依次偶联Fmoc‑Lys(Mtt)‑OH，Fmoc‑Trp(Boc)‑OH,Fmoc‑Arg(pbf)‑OH，Fmoc‑D‑Phe‑OH，Fmoc‑His(Boc)‑OH，Fmoc‑Asp(O‑2‑Phipr)‑OH，Fmoc‑Nle‑OH，Fmoc‑Nle‑OH，偶联完成后脱除Fmoc保护基，以乙酸酐/吡啶进行乙酰化，得AC‑Nle‑Asp(O‑2‑Phipr)‑His(Boc)‑D‑Phe‑Arg(pbf)‑Trp(Boc)‑Lys(Mtt)‑O‑(CH2)n‑CONH‑Rink Amide Resin；(c)：采用TFA/DCM溶液，选择性脱除Lys侧链保护基Mtt，Asp侧链保护基O‑2‑Phipr，得AC‑Nle‑Asp‑His(Boc)‑D‑Phe‑Arg(pbf)‑Trp(Boc)‑Lys‑O‑(CH2)n‑CONH‑Rink Amide Resin；(d)：在偶联剂存在条件下进行树脂上环化，得：AC‑Nle‑[Asp‑His(Boc)‑D‑Phe‑Arg(pbf)‑Trp(Boc)‑Lys]cycle‑O‑(CH2)n‑CONH‑Rink Amide Resin；(e)：在裂解剂存在条件下，将肽树脂裂解及侧链脱保护，得：AC‑Nle‑[Asp‑His‑D‑Phe‑Arg‑Trp‑Lys]cycle‑O‑(CH2)n‑CONH2；(f)：以乙腈/水将AC‑Nle‑[Asp‑His‑D‑Phe‑Arg‑Trp‑Lys]cycle‑O‑(CH2)n‑CONH2溶解，在碱性条件下酯键水解，溶液调酸后得布美诺肽粗肽；(g)：布美诺肽粗肽经过纯化，冻干，得布美诺肽精肽。...

【技术特征摘要】
1.一种布美诺肽的固相合成方法，包括如下步骤：
(a)：RinkAmideResin与长链脂肪羟基酸HO-(CH2)n-COOH偶联合成HO-(CH2)n-CONH-
RinkAmideResin；
(b)：依照布美诺肽序列，在偶联剂存在条件下，依次偶联Fmoc-Lys(Mtt)-OH，Fmoc-Trp
(Boc)-OH,Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-D-Phe-OH，Fmoc-His(Boc)-OH，Fmoc-Asp(O-2-Phipr)-
OH，Fmoc-Nle-OH，Fmoc-Nle-OH，偶联完成后脱除Fmoc保护基，以乙酸酐/吡啶进行乙酰化，
得AC-Nle-Asp(O-2-Phipr)-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(Mtt)-O-(CH2)n-
CONH-RinkAmideResin；
(c)：采用TFA/DCM溶液，选择性脱除Lys侧链保护基Mtt，Asp侧链保护基O-2-Phipr，得
AC-Nle-Asp-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys-O-(CH2)n-CONH-RinkAmide
Resin；
(d)：在偶联剂存在条件下进行树脂上环化，得：AC-Nle-[Asp-His(Boc)-D-Phe-Arg
(pbf)-Trp(Boc)-Lys]cycle-O-(CH2)n-CONH-RinkAmideResin；
(e)：在裂解剂存在条件下，将肽树脂裂解及侧链脱保护，得：AC-Nle-[Asp-His-D-Phe-
Arg-Trp-Lys]cycle-O-(CH2)n-CONH2；
(f)：以乙腈/水将AC-Nle-[Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys]cycle-O-(CH2)n-CONH2溶解，在
碱性条件下酯键水解，溶液调酸后得布美诺肽粗肽；
(g)：布美诺肽粗肽经过纯化，冻干，得布美诺肽精肽。
2.根据权利要求1所述的一种布美诺肽的固相合成方法，其特征在于，步骤(a)中，所述
长链脂肪羟基酸HO-(CH2)n-COOH为8-羟基辛酸或16-羟基十六酸，n等于7或15。
3.根据权利要求1所述的一种布美诺肽的固相合成方法，其特征在于，步骤(a)中，所述
RinkAmideResin的替代度为0.4～0.6mmol/g。
4.根据权利要求1所述的一种布美诺肽的固相合成方法，其特征在于，所述步骤(b)和
步骤(d)中缩合剂组合为DMAP/DIC/HOBT，DMAP/DIC/HOAT，DIC/HOBT，DIC/HOAT，HBTU/HOBT/
DIPEA，HATU/HOAT/DIPEA中的一种。
5.根据权利要求1所述的一种布美诺肽的固相合成方法，其特征在于，步骤(c)中，所述
TFA/DCM溶液，TFA所占体积比为3～5％。
6.根据权利要求1所述的一种布美诺肽的固相合成方法，其特征在于，步骤(e)中，所述
裂解试剂为加入体积比1-5％清除剂的TFA溶液，所述清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫
醇、巯基乙醇、苯酚、水、三异丙基硅烷中的一种或几种。
7.根据权利要求1所述的一种布美诺肽的固相合成方法，其特征在于，步骤(f)中，所述
乙腈/水体系中，乙腈所占的比例为5～15％，所述碱为氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化锂中的
一种。
8.根据权利要求1所述的一种布美诺肽的固相合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)以0.52mmol/g的RinkAmideResin为固相载体，在DIC/HOBT存在下，与HO-(CH2)7-
COOH偶联，合成HO-(CH2)7-CONH-RinkAmideResin；
(b)：依照布美诺肽序列，在DMAP/DIC/HOBT存在条件下，偶联Fmoc-Lys(Mtt)-OH，在
DIC/HOBT存在条件下，依次偶联Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-D-Phe-OH，
Fmoc-His(Boc)-OH，Fmoc-Asp(O-2-Phipr)-OH，Fmoc-Nle-OH，Fmoc-Nle-OH，偶联完成后脱
除Fmoc保护基，以乙酸酐/吡啶进行乙酰化，得AC-Nle-Asp(O-2-Phipr)-H...

【专利技术属性】
技术研发人员：张颖，陈雷，王仁友，李同金，石鑫磊，
申请(专利权)人：济南康和医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37