探针及其用途制造技术

技术编号:15128359 阅读:808 留言:0更新日期:2017-04-10 07:45
本发明专利技术公开了探针及其用途,其中该一组探针特异性识别FLG基因编码区的至少一部分,且满足选自下列条件的至少之一:(1)探针的长度为75bp;(2)探针特异性识别FLG基因编码区上游10bp至下游10bp之间的序列;(3)特异性识别GC含量高于0.6及低于0.3的区域的探针,乘数大于2;(4)探针与目标序列的熔解温度为60-10摄氏度优选80摄氏度;(5)探针不包含发夹结构;(6)探针与参考基因组上的至多2个位点匹配;(7)探针选择时的窗口滑动大小为10bp。该组探针对其特异性识别的FLG基因编码区的至少一部分的捕获特异性好、灵敏度和覆盖度非常高,能够有效用于进行FLG基因编码区的捕获检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
,尤其是目标基因高通量测序
具体地,本专利技术涉及探针及其用途,更具体地,本专利技术涉及一组探针、构建高通量测序文库的方法、确定待测样本FLG基因编码区核酸序列的方法、构建高通量测序文库的装置以及确定待测样本FLG基因编码区核酸序列的系统。
技术介绍
寻常型鱼鳞病(Ichthyosisvulgaris)是一种常染色体显性遗传病,该疾病的发病率为1:250-1:1000。主要临床症状包括皮肤损害呈“鱼鳞”或“蛇皮”状,毛囊角化丘疹,毛孔呈点状,手纹和脚纹多、深、乱。与该疾病相关的基因是位于1q21.3的编码丝聚蛋白(Filaggrin)的FLG基因,该基因是表皮分化末期编码结构蛋白的基因簇的一部分。FLG基因全长12.7–14.7kb,包含3个外显子(Exon),Exon1(15bp)是非编码序列,Exon2(159bp)包含起始编码序列,Exon3(12-14kb)包括N末端和编码丝聚蛋白的10-12个长度达1k的重复序列。目前,FLG基因检测方法主要是进行长PCR,然后对长PCR产物进行巢式扩增,得到特异性的目的序列后,结合sanger测序解读FLG序列。然而,这段序列不仅组合复杂,还具有个体特异性,使用该方法时常会出现未得到特异性序列或测序失败,实验过程很不稳定,导致不能彻底解读FLG。另外,第一代测序仪同时测序的样本数少,且需要先经过PCR过程,工作量大,通量小,检出率不到30%。因而,目前的FLG基因检测方法仍有待改进。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此,本专利技术的一个目的在于提出一种能够高效检测特异性序列、彻底解读FLG基因,且实验过程稳定、工作量小,通量大的FLG基因检测方法。需要说明的是,本专利技术是基于专利技术人的下列工作而完成的:专利技术人利用目标区域捕获技术,使用特异的外显子捕获芯片对人FLG基因进行高通量测序。该技术的基本原理是使用一套寡核苷酸探针来捕获基因组上的目标序列,然后使用通用引物对这些捕获到的序列进行PCR扩增,再对这些扩增产物进行高通量测序,从而识别DNA样品中的碱基序列,通过生物信息分析方法对测序所得序列信息进行分析,从而找到目标序列的变异信息,包括单核苷酸变异,插入/缺失,重复等,该方法可大幅提高FLG基因的检出率,约为83%。进而,根据本专利技术的一个方面,本专利技术提供了一组探针。根据本专利技术的实施例,所述一组探针特异性识别FLG基因编码区的至少一部分,且所述探针满足选自下列条件的至少之一:(1)所述探针的长度为75bp;(2)所述探针特异性识别FLG基因编码区上游10bp至下游10bp之间的序列;(3)特异性识别GC含量高于0.6及低于0.3的区域的探针,乘数大于2;(4)所述探针与目标序列的熔解温度为60-10摄氏度,优选80摄氏度;(5)所述探针不包含发夹结构;(6)所述探针与参考基因组上的至多2个位点匹配;(7)所述探针选择时的窗口滑动大小为10bp。专利技术人惊奇地发现,本专利技术的一组探针,对其特异性识别的FLG基因编码区的至少一部分的捕获特异性好、灵敏度和覆盖度非常高,能够有效用于进行FLG基因编码区的捕获检测。根据本专利技术的实施例,利用本专利技术的一组探针能够准确有效地捕获探针特异性识别的目标序列——FLG基因编码区的至少一部分,从而能够有效构建获得目标序列的核酸测序文库,进一步,将该核酸测序文库用于高通量测序,能够有效确定FLG基因编码区的至少一部分的序列信息,并且目标序列的测序深度高,数据利用率高,进而能够实现对FLG基因的检测。此外,利用上述方法构建高通量测序文库,并进而用于FLG基因检测,特异性好、灵敏度和覆盖度高,可重复性好,从而能够成功解读FLG基因,发现突变,且该方法实验过程稳定、成本低、操作简单、工作量小、易推广。根据本专利技术的另一方面,本专利技术提供了一种构建高通量测序文库的方法。根据本专利技术的实施例,该方法包括以下步骤:将基因组DNA片段化,以便获得DNA片段;将所述DNA片段进行末端修复,以便获得经过末端修复的DNA片段;在所述经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A,以便获得具有粘性末端A的DNA片段;将所述具有粘性末端A的DNA片段与接头相连,以便获得连接产物;利用前面所述的一组探针对所述连接产物进行筛选,以便获得目的片段,所述目的片段构成所述高通量测序文库。根据本专利技术的实施例,本专利技术所采用的一组探针对其特异性识别的FLG基因编码区的至少一部分的捕获特异性好、灵敏度和覆盖度非常高,能够有效用于进行FLG基因编码区的捕获检测。进而,利用本专利技术的方法能够准确有效地捕获探针特异性识别的目标序列——FLG基因编码区的至少一部分,构建目标序列的核酸测序文库,进而将该核酸测序文库用于高通量测序后,能够有效确定FLG基因编码区的至少一部分的序列信息,并且目标序列的测序深度高,数据利用率高,进而能够实现对FLG基因的检测。此外,利用本专利技术的方法构建高通量测序文库,进而用于FLG基因检测,特异性好、灵敏度和覆盖度高,可重复性好,从而能够成功解读FLG基因,发现突变,且该方法实验过程稳定、成本低、操作简单、工作量小、易推广。根据本专利技术的又一方面,本专利技术提供了一种确定待测样本FLG基因编码区核酸序列的方法。根据本专利技术的实施例,该方法包括以下步骤:根据前面所述的构建高通量测序文库的方法,构建待测样本的高通量测序文库,所述高通量测序文库包含FLG基因编码区核酸序列;对所述待测样本的高通量测序文库进行测序,以便获得测序结果;以及基于所述测序结果,确定所述待测样本FLG基因编码区的核酸序列。专利技术人发现,本专利技术所采用的一组探针对其特异性识别的FLG基因编码区的至少一部分的捕获特异性好、灵敏度和覆盖度非常高,能够有效用于FLG基因编码区的捕获检测。进而,利用本专利技术的方法能够准确有效地捕获探针特异性识别的目标序列——FLG基因编码区的至少一部分,构建目标序列的核酸测序文库,并进行高通量测序,从而能够有效确定FLG基因编码区的至少一部分的序列信息,并且目标序列的测序深度高,数据利用率高,进而能够实现对FLG基因的检测。此外,利用本专利技术的方法构建高通量测序文库,并确定待测样本FLG基因编码区核酸序列,特异性好、灵敏度和覆盖度高,可重复性好,结果准确可靠,从而能够成功解读FLG基因,发现突变,且该方法实验过程稳定、成本低、操作简单、工作量小、易推广。根据本专利技术的再一方面,本专利技术提供了一种构建高通量测序文库的装置。根据本发本文档来自技高网
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【技术保护点】
一组探针,其特征在于,所述一组探针特异性识别FLG基因编码区的至少一部分,且所述探针满足选自下列条件的至少之一:(1)所述探针的长度为75bp;(2)所述探针特异性识别FLG基因编码区上游10bp至下游10bp之间的序列;(3)特异性识别GC含量高于0.6及低于0.3的区域的探针,乘数大于2;(4)所述探针与目标序列的熔解温度为60‑10摄氏度,优选80摄氏度;(5)所述探针不包含发夹结构;(6)所述探针与参考基因组上的至多2个位点匹配;(7)所述探针选择时的窗口滑动大小为10bp。

【技术特征摘要】
1.一组探针,其特征在于,所述一组探针特异性识别FLG基因编码区的至少一部分,
且所述探针满足选自下列条件的至少之一:
(1)所述探针的长度为75bp;
(2)所述探针特异性识别FLG基因编码区上游10bp至下游10bp之间的序列;
(3)特异性识别GC含量高于0.6及低于0.3的区域的探针,乘数大于2;
(4)所述探针与目标序列的熔解温度为60-10摄氏度,优选80摄氏度;
(5)所述探针不包含发夹结构;
(6)所述探针与参考基因组上的至多2个位点匹配;
(7)所述探针选择时的窗口滑动大小为10bp。
2.根据权利要求1所述的一组探针,其具有SEQIDNO:1-1095所示的核酸序列,
任选地,所述一组探针游离于溶液,
任选地,所述一组探针结合于固相基质上,形成芯片,
任选地,所述参考基因组为所述待测样本来源物种的参考基因组序列,优选人类参考基
因组。
3.一种构建高通量测序文库的方法,其特征在于,包括以下步骤:
将基因组DNA片段化,以便获得DNA片段;
将所述DNA片段进行末端修复,以便获得经过末端修复的DNA片段;
在所述经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A,以便获得具有粘性末端A的
DNA片段;
将所述具有粘性末端A的DNA片段与接头相连,以便获得连接产物;
利用权利要求1或2所述的一组探针对所述连接产物进行筛选,以便获得目的片段,所
述目的片段构成所述高通量测序文库。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,进一步包括从样本中提取基因组DNA的
步骤,优选所述样本来源于哺乳动物,更优选所述哺乳动物为人和小鼠的至少一种,优选所
述基因组DNA为人类全血基因组DNA,
任选地,利用covaris-S2打断仪将基因组DNA片段化,
任选地,所述DNA片段的长度为约200-250bp,
任选地,在将所述DNA片段进行末端修复前,进一步包括纯化DNA片段的步骤,
任选地,将所述DNA片段进行末端修复是利用Klenow片段、T4DNA聚合酶和T4多
核苷酸激酶进行的,其中,所述Klenow片段具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’聚合酶活性,
但缺少5’→3’外切酶活性,
任选地,将所述经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A是利用Klenow(3’-5’
exo-)进行的,
任选地,将所述具有粘性末端A的DNA片段与接头相连是利用T4DNA连接酶进行的,
任选地,所述高通量测序文库适于利用高通量测序技术优选Hiseq2000测序平台进行测
序,
任选地,利用固相芯片杂交捕获技术进行所述筛选。
5.一种确定待测样本FLG基因编码区核酸序列的方法,其特征在于,包括以下步骤:
根据权利要求3或4所述的方法,构建待测样本的高通量测序文库,所述高通量测序文
库包含FLG基因编码区核酸序列;
对所述待测样本的高通量测序文库进行测序,以便获得测序结果;以及
基于所述测序结果,确定所述待测样本FLG基因编码区的核酸序列。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,利用高通量测序技术优选Hiseq2000测
序平台进行所述测序,
任选地,进一步包括:
将所述待测样本FLG基因编码区的核酸序列与参考基因组序列进行比对,以便确定所
述待测样本FLG基因编码区是否存在突变,并获得变异信息,

【专利技术属性】
技术研发人员:魏晓明杨昀田甜孙岩
申请(专利权)人:武汉华大医学检验所有限公司深圳华大基因医学有限公司
类型:发明
国别省市:湖北;42

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