一种非诊断目的的痰液微生物耐药性基因的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种非诊断目的的痰液微生物耐药性基因的检测方法。所述方法包括：确定耐药性基因、内源标准基因和外源标准基因；制备多重扩增引物；向待测样品中加入外源核酸，得到混合样品并提取基因组；向基因组中加入外源标准基因，获得混合核酸；扩增混合核酸，利用扩增产物构建高通量测序文库并进行高通量测序，得到测序片段组；分析所述测序片段组，并根据获得的外源标准基因和内源标准基因的测序片段的数量，判断实验是否成功；若实验成功，则计算耐药性基因的含量；根据耐药性基因的含量判定待测样品是否含有耐药性基因。所述方法可以一次性定量检测任意微生物中的任意多种希望检测的耐药性基因，且检测不需要培养与纯化微生物，速度快，结果准确可靠。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别涉及一种痰液微生物耐药性基因的检测方法。
技术介绍
抗生素类药物广泛应用于防治人体疾病，滥用抗生素类药物会导致微生物进化出耐药性基因，并产生耐药性，这使得抗生素类药物在防治疾病时失效。痰液中微生物耐药性基因是多种疾病特别是呼吸道类疾病用药的重要依据。现有的检测耐药性基因的方法包括：预估待测样品上携带的需要检测的耐药性基因的病原菌，分离并纯化该病原菌，通过PCR(PolymeaseChainReaction，聚合酶链式反应)引物扩增该耐药性基因，利用电泳或实时定量PCR方法逐一判断待测样品中是否存在需要检测的耐药性基因。在实现本专利技术的过程中，专利技术人发现现有技术至少存在以下问题中的一种：需要培养、分离和纯化病原菌，使得检测的时间较长，延误治疗时机；无法检测不可培养的耐药菌中的耐药性基因；一次只能针对一种或少数几种病原菌进行检测；一次只能检测一种或少数几种耐药性基因，不能检测到待测样品中所有的耐药性基因，不能给予用药所需的全面信息；不能实现耐药性基因的定量检测。
技术实现思路
为了解决现有技术中检测耐药性基因的方法有待提高的问题，本专利技术实施例提供了一种痰液微生物耐药性基因的检测方法。所述技术方案如下：本专利技术实施例提供了一种痰液微生物耐药性基因的检测方法，所述方法包括：确定待测样品中需要检测的微生物的耐药性基因、所述待测样品中的内源标准基因和所述待测样品的外源标准基因，所述待测样品为痰液；制备用于扩增所述耐药性基因、所述内源标准基因和所述外源标准基因的测试区域的多重扩增引物；向所述待测样品中加入所述多重扩增引物不能扩增的外源核酸，得到混合样品；提取所述混合样品的基因组；向所述混合样品的基因组中加入所述外源标准基因，获得混合核酸；利用所述多重扩增引物对所述混合核酸进行扩增，得到扩增产物，利用所述扩增产物构建高通量测序文库；对所述高通量测序文库进行高通量测序，得到测序片段组；分析所述测序片段组，获得所述待测样品中所述耐药性基因的测序片段的数量、所述内源标准基因的测序片段的数量和所述外源标准基因的测序片段的数量；根据所述外源标准基因的测序片段的数量和所述内源标准基因的测序片段的数量，判断实验是否成功；若所述实验成功，则计算所述待测样品中所述耐药性基因的含量；根据所述耐药性基因的含量判定所述待测样品是否含有耐药性基因。具体地，所述耐药性基因至少为1个，所述内源标准基因至少为1个，所述外源标准基因至少为1个。具体地，所述内源标准基因为所述待测样品的微生物中的基因。具体地，所述外源标准基因不存在于已知基因组的生物中。具体地，用于扩增所述耐药性基因的引物的设计区域或扩增区域与所述待测样品中的生物的基因组的其它区域的所有生物的基因组上除耐药性基因外的其它区域的同源性低于98％。具体地，所述判断实验是否成功的方法为：当所述外源标准基因的测序片段的数量和所述内源标准基因的测序片段的数量均≥α1时，则实验成功；当所述外源标准基因的测序片段的数量或所述内源标准基因的测序片段的数量<α1时，则实验失败；其中，α1为判定阈值。具体地，计算所述待测样品中所述耐药性基因的含量的方法为：第m种所述耐药性基因的含量的计算公式为其中，i为第m种所述耐药性基因的第i个测试区域，n1为所述第m种所述耐药性基因的测试区域的个数，bi为所述第m种耐药性基因的第i个测试区域的测序片段的数量，k为第k种所述内源标准基因，n3为所述内源标准基因的个数，j为第k种所述内源标准基因的第j个测试区域，n2为第k种所述内源标准基因的测试区域的个数，aj为第k种所述内源标准基因的第j种测试区域的测序片段的数量；N为所有所述内源标准基因的测试区域的总数。具体地，判定所述待测样品中是否含有所述耐药性基因的方法为：所述耐药性基因的含量≥α2时，判定所述待测样品含有所述耐药性基因；当所有所述耐药性基因的含量<α2时，判定所述待测样品不含有所述耐药性基因；其中，α2为判定阈值。具体地，所述外源标准基因的质量与所述混合样品的基因组的总质量的比例大于1/100000。本专利技术实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本专利技术实施例提供的方法可以在不需要培养与纯化的前提下，一次性的、定量的、快速的、准确的检测任意数量和类型的微生物中的任意多种希望检测的耐药性基因，可以给予用药所需的全面信息。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施方式作进一步地详细描述。实施例人体痰液微生物的耐药性基因检测人体痰液微生物反应了人体多种疾病特别是呼吸道类疾病病原微生物的种类与数量，是疾病诊断与治疗的依据。本实施例中使用的痰液样品取自咳嗽病人，检测其痰液中的微生物的耐药性基因是为了给医生使用抗生素类药物治疗提供依据。本实施例包括如下步骤：步骤1、确定待测样品中需要检测的微生物的耐药性基因、待测样品中的内源标准基因和待测样品的外源标准基因，具体方法如下：其中，耐药性基因至少为1个，内源标准基因至少为1个，外源标准基因至少为1个。内源标准基因为待测样品的微生物中的基因。外源标准基因不存在于已知基因组的生物中。本实施例中的耐药性基因抗青霉素、β-内酰胺酶、头孢菌素酶、卡那霉素和新霉素，其中，耐药性基因APH(3')-Ia同时抗卡那霉素和新霉素。本实施例中内源标准基因为1种，具体地，内源标准基因为核糖体rRNA基因，该核糖体rRNA基因存在于绝大部分生物中且具有保守区域。在本实施例中，外源标准基因为1种，具体地，外源标准基因为ERCC-00004基因，其在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上进行同源比对时，未发现其在已知生物参考基因组中存在同源序列，即外源标准基因不存在于已知的生物基因组中。表1为本实施例中被检测基因相关信息与检测结果，在表1中耐药性基因名称与序列编号与抗生素耐药性数据库(CRAD：TheComprehensiveAntibioticResistanceDatabase，网址为http://arpcard.mcmaster.ca/)中的名称与序列编号一致。表1为本实施例中被检测基因相关信息与检测结果表1中“/”表示无。步骤2、制备用于扩增耐药性基因、内源标准基因和外源标准基因的测试区域的多重扩增引物，具体方法如本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种痰液微生物耐药性基因的检测方法，其特征在于，所述方法包括：确定待测样品中需要检测的微生物的耐药性基因、所述待测样品中的内源标准基因和所述待测样品的外源标准基因，所述待测样品为痰液；制备用于扩增所述耐药性基因、所述内源标准基因和所述外源标准基因的测试区域的多重扩增引物；向所述待测样品中加入所述多重扩增引物不能扩增的外源核酸，得到混合样品；提取所述混合样品的基因组；向所述混合样品的基因组中加入所述外源标准基因，获得混合核酸；利用所述多重扩增引物对所述混合核酸进行扩增，得到扩增产物，利用所述扩增产物构建高通量测序文库；对所述高通量测序文库进行高通量测序，得到测序片段组；分析所述测序片段组，获得所述待测样品中所述耐药性基因的测序片段的数量、所述内源标准基因的测序片段的数量和所述外源标准基因的测序片段的数量；根据所述外源标准基因的测序片段的数量和所述内源标准基因的测序片段的数量，判断实验是否成功；若所述实验成功，则计算所述待测样品中所述耐药性基因的含量；根据所述耐药性基因的含量判定所述待测样品是否含有耐药性基因。

【技术特征摘要】
1.一种痰液微生物耐药性基因的检测方法，其特征在于，所述方法包括：
确定待测样品中需要检测的微生物的耐药性基因、所述待测样品中的内源
标准基因和所述待测样品的外源标准基因，所述待测样品为痰液；
制备用于扩增所述耐药性基因、所述内源标准基因和所述外源标准基因的
测试区域的多重扩增引物；
向所述待测样品中加入所述多重扩增引物不能扩增的外源核酸，得到混合
样品；
提取所述混合样品的基因组；
向所述混合样品的基因组中加入所述外源标准基因，获得混合核酸；
利用所述多重扩增引物对所述混合核酸进行扩增，得到扩增产物，利用所
述扩增产物构建高通量测序文库；
对所述高通量测序文库进行高通量测序，得到测序片段组；
分析所述测序片段组，获得所述待测样品中所述耐药性基因的测序片段的
数量、所述内源标准基因的测序片段的数量和所述外源标准基因的测序片段的
数量；
根据所述外源标准基因的测序片段的数量和所述内源标准基因的测序片段
的数量，判断实验是否成功；
若所述实验成功，则计算所述待测样品中所述耐药性基因的含量；
根据所述耐药性基因的含量判定所述待测样品是否含有耐药性基因。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述耐药性基因至少为
1个，所述内源标准基因至少为1个，所述外源标准基因至少为1个。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述内源标准基因为所
述待测样品的微生物中的基因。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述外源标准基因不存
在于已知基因组的生物中。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，用于扩增所...

【专利技术属性】
技术研发人员：李论，高利芬，彭海，
申请(专利权)人：江汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42