小管福寿螺和斑点福寿螺为近缘种，形态极为近似，利用形态特征进行种类的鉴定与鉴别十分困难。本发明专利技术公开了一种辅助鉴别及检测两种入侵性福寿螺的多重特异引物对及其应用。本发明专利技术提供的特异引物对，由序列表的序列1、序列2和序列3所示DNA序列组成。应用本发明专利技术的特异引物对可以从分子水平辅助鉴别及检测两种入侵性福寿螺，不受标本个体发育状态及样品完整性的影响，具有经济高效、便捷准确、灵敏度高的优点。本发明专利技术解决了长期以来困扰植物保护和口岸检疫部门的我国外来入侵福寿螺种类鉴定问题。本发明专利技术可在植物保护部门和检疫部门广泛应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一组辅助鉴别外来入侵生物福寿螺的特异引物对及其应用，属于生物
技术介绍
福寿螺隶属于软体动物门（Mollusca），腹足纲（Gastropoda），新进腹足目（Caeogastropoda），瓶螺科（Ampullariidae），福寿螺属（PomaceaPerry，1810）。福寿螺自20世纪80年代初作为食物引种并定殖到我国，但由于其口味欠佳而被人们弃养，并在田间大量繁殖；目前该螺已迅速扩展到浙江、福建、广东、广西、海南、云南、贵州、江西、四川、重庆、湖南和安徽等省份并为害成灾。福寿螺可为害多种水生农作物，对我国南方水稻生产造成严重损失；同时福寿螺破坏水生生态系统平衡，造成生态危害；寄生多种寄生虫，包括人畜共患的“广州管圆线虫”，该螺的分布直接影响寄生虫病的流行范围与传播强度。因而，研究福寿螺的扩散和发生具有重大的实际意义。小管福寿螺Pomaceacanaliculata(Lamarck,1822)是我国首批公布的外来入侵有害生物，也是世界公认的100种恶性外来入侵物种之一；斑点福寿螺P.maculata(Perry,1810)于2010年首次在我国报道分布（潘颖瑛等，2010），近年来在我国多地被检测到有分布（Lvetal.,2012;Huetal.,2014）。两种福寿螺在我国南方主要水稻种植区广泛为害，均为我国重要的外来入侵有害生物。小管福寿螺P.canaliculata与斑点福寿螺P.maculata为近缘种，在形态特征和生活习性等多方面高度相似；此外，由于福寿螺高度的环境适应能力，易受食物源、外界环境和发育期等因素影响，极易发生螺种内形态特征变异，因而从形态上鉴别两种福寿螺存在很大困难和不确定性。准确的物种鉴定是一切生物学研究的基础，也是制定有害生物有效防治措施的关键。近年来分子生物学技术快速发展，通过基因序列扩增、不同种间基因变异程度的比较从而完成种类的快速、准确鉴定已成为可能。分子鉴定具有快速准确及简便快捷的优点，同时不受生活史阶段及样品完整性的限制，可以极大地弥补传统形态学鉴定的缺陷。本专利技术的目的是提供一种基于多重PCR辅助鉴定外来入侵物种小管福寿螺P.canaliculata与斑点福寿螺P.maculata的特异引物对及其应用。含有本专利技术所述引物对的试剂盒也属于本专利技术的保护范围，试剂盒包含上述特异引物对及PCR反应体系、扩增程序及产物检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种辅助快速鉴别我国两种外来入侵福寿螺的多重PCR特异引物对及其应用。本专利技术提供的辅助鉴定福寿螺的特异引物对，由序列表的序列1所示DNA序列上游引物，序列表的序列2和序列3所示DNA（下游引物）组成。所述特异引物对可用于辅助快速鉴别两种入侵性福寿螺。所述特异引物对可用于制备辅助快速鉴别两种入侵性福寿螺的试剂盒。本专利技术还保护一种辅助快速鉴别两种入侵性福寿螺的试剂盒，包括所述多重PCR特异引物对。本专利技术还保护一种辅助快速鉴别两种入侵性福寿螺的方法，包括如下步骤：以待测福寿螺的基因组DNA（或所述基因组DNA的稀释液）为模板，用所述特异引物对进行PCR扩增，经电泳成像显示：如果得到PCR扩增产物条带且条带大小为508bp，则待测福寿螺样品为小管福寿螺；如果得到PCR扩增产物且条带大小为299bp，待测福寿螺样品为非小管福寿螺；利用PCR产物条带大小可以快速区分两种入侵性福寿螺。所述PCR扩增的反应体系具体可为（25μl）：Taqpolymerase0.25μl，10×Taqbuffer2.5μl，Mg2+buffer2.5μl，dNTPmixture2μl，所述上游引物（10μM）1μl，所述两条下游引物（10μM）各0.5μl，基因组DNA1μl，ddH2O14.75μl。所述PCR扩增的反应参数具体可为：94℃预变性3min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸40sec，35个循环；72℃延伸5min。所述待测福寿螺可为福寿螺属福寿螺，福寿螺P.canaliculata译名为“小管福寿螺”、福寿螺P.maculata译名为“斑点福寿螺”。本专利技术还保护一种从福寿螺中辅助鉴别两种入侵性福寿螺的方法，包括如下步骤：以待测福寿螺的基因组DNA为模板，用所述特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物为508bp的待测福寿螺为候选的小管福寿螺，得到PCR扩增产物为299bp的待测福寿螺为候选的斑点福寿螺。利用扩增条带的大小可以快速鉴别两种入侵性福寿螺。本专利技术的目的是提供一种辅助快速鉴别两种入侵性福寿螺的特异引物对及其应用。含有本专利技术所述引物对的试剂盒也属于本专利技术的保护范围，试剂盒包含上述特异引物对及PCR反应体系、扩增程序及产物检测方法。本专利技术针对植物保护及口岸检疫部门外来入侵福寿螺种类鉴定应用的现实需要，设计筛选了鉴别两种入侵性福寿螺的特异引物对，并专利技术了鉴别和检测两种入侵性福寿螺的方法。本专利技术的特点是：（1）种类鉴定过程快速高效，鉴定结果准确可靠。特异引物试剂盒检测通过PCR扩增针对两种入侵性福寿螺特异性地扩增出不同大小的产物，检测灵敏度高，耗时短，且可以实现高通量检测。（2）鉴定对象不受种类性别，发育阶段和形态鉴定特征完整程度的影响。传统形态鉴定方法一般只针对成螺的形态特征，需要专业的分类学知识，对样品完整性等要求高。（3）鉴定过程操作简便，经济易行。特异引物分子鉴定方法可标准化，操作简便且所需费用较低，便于无专业分类学知识背景的工作人员操作与运用。附图说明图1多重PCR特异引物对PomF/PcanR/PmacR2检测不同地理种群的入侵性福寿螺的凝胶电泳图。图2多重PCR特异引物对PomF/PcanR/PmacR2检测不同发育阶段的两种入侵性福寿螺的凝胶电泳图。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例进一步说明本
技术实现思路
，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施样本包括采自不同地点的小管福寿螺和斑点福寿螺，该两种福寿螺的中译名在文献为“杨倩倩,王正亮,刘光富,俞晓平.我国外来入侵种福寿螺分子生物学研究进展.中国计量学院学报,2014,25(2):122-128.”以及“周晓农,张仪,吕山.‘福寿螺’学名中译名的探讨.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2009,27:62~64.”中公开过，公众均可以从中国计量学院获得。实施例1：多重PCR特异引物对的设计本专利技术在获取两种外来入侵福寿螺线粒体COI基因DNA条形码区段的基础上，经过序列的多重比对分析，针对两种入侵性福寿螺设计特异引物对，如表1所示。在福寿螺属的常见福寿螺线粒体细胞色素氧化酶亚基I条形码（m本文档来自技高网...
【技术保护点】
辅助鉴别及检测两种入侵性福寿螺的特异引物对，由序列表的序列1、序列2和序列3所示DNA序列组成。
【技术特征摘要】
1.辅助鉴别及检测两种入侵性福寿螺的特异引物对，由序列表的序列1、序列2和序列3所示DNA序列组成。
2.权利要求1所述特异引物对在辅助鉴别及检测两种入侵性福寿螺中的应用。
3.权利要求1所述特异引物对在制备辅助鉴别及检测两种入侵性福寿螺的试剂盒中的应用。
4.一种辅助鉴别及检测两种入侵性福寿螺的试剂盒，包括权利要求1所述特异引物对。
5.一种辅助鉴别及检测两种入侵性福寿螺的方法，包括如下步骤：以待测福寿螺的基因组DNA为模板，用权利要求1所述特异引物对进行PCR扩增，如果得到PCR扩增产物较大待测福寿螺为候选的小管福寿螺P.canaliculata，如果得到PCR扩增产物较小待测福寿螺为候选的斑点福寿螺P.macula...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨倩倩，俞晓平，刘苏汶，张蓬军，许益鹏，刘光富，蒋家成，
申请(专利权)人：中国计量学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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