一种Bim基因缺失荧光定量PCR检测引物及探针、检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种Bim基因缺失荧光定量PCR检测引物及探针、检测试剂盒，属于分子生物学检测领域。本发明专利技术引物及探针包括：正向引物：5’-CAACAAACCCATCAGAACAGACAC-3’、反向引:5’-ACAGCCTCTATGGAGAACAGTGATT-3’，荧光探针:5’-FAM-CAGACACTGGAACAAA-MGB-3’，所述试剂盒除包含引物及探针外，还包含PCR反应液预混液、阳性对照样品A。利用本发明专利技术检测引物及探针、检测试剂盒进行Bim基因缺失突变的检测，简便易行、准确率高、灵敏度高，尤其是适用于临床样本检测，通过检测BIM缺失突变，便于指导机体的个性化治疗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种Bim基因缺失荧光定量PCR检测引物及探针、检测试剂盒。
技术介绍
目前，肺癌在欧美等发达国家及我国恶性肿瘤中病死率最高，且其发病率逐年上升，其中NSCLC占80％～85％。近年来，肺癌的靶向治疗已取得重大进展，多类高效低毒的靶向药物相继问世，并应用于临床，主要有以EGFR为靶点的靶向治疗、以血管生成为靶点的靶向治疗、基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP)、以法基尼转移酶为靶点的靶向治疗、肺癌反义寡核苷酸靶向治疗和肺癌靶向疫苗等；吉非替尼为靶向治疗的代表性药物，为信号传导通路酪氨酸激酶抑制剂。此外，以腺病毒为载体的基因治疗在临床中有着广泛的应用前景。目前多数研究证实，吉非替尼等EGFR-TKI可通过增加细胞内Bim数量诱导细胞内源性凋亡。Bim重组腺病毒转染对EGFR突变NSCLC细胞凋亡具有诱导作用，可能机制为上调细胞内Bim蛋白表达；此为NSCLC的基因治疗提供了依据，但关于Bim肿瘤抑制因子在肿瘤基因治疗方面的研究甚少。Bim作为重要的凋亡调节蛋白，不仅在消除自身免疫，维持造血细胞内环境的稳定中起着重要的调节作用，而且对病理损伤(如神经退行性变、肿瘤、癫痫等)细胞具有强大的杀伤功能。有关细胞凋亡的研究使人们意识到，诱导细胞凋亡可作为治疗肿瘤的新途径。Bim为近年来研究比较热门的一种凋亡调节蛋白，已有研究报道人类Bim基因定位的染色体区域位于很多肿瘤的染色体区域内，且主要是造血系统来源的肿瘤。Bim基因的缺失可导致多种肿瘤的发生，其中多为造血系统肿瘤，从而强有力地证明Bim是一种肿瘤抑制因子。王等用免疫组织化学方法研究发现在正常增殖期子宫内膜、非典型增生子宫内膜、子宫内膜癌这一过程中Bim蛋白的表达量逐渐降低。Bim的促调亡功能，使其成为肿瘤基因治疗中的一个理想靶目标。Bim(Bcl-2interactingmediatorofcelldeath)是Bcl-2家族中BH3-only亚家族成员，是一种重要的凋亡调节蛋白，是O’connoretall于1998年发现的，人类Bim基因位于2q12或2q13，由6个外显子和3个内含子组成。Bim异构体的形成是由Bim前体mRNA的选择性剪接而产生。由于各异构体mRNA保留了不同的外显子序列，从而使得Bim各异构体具有不同的结构域，促凋亡活性也有所不同。目前已发现Bim存在11种异构体。Bim蛋白属于Bcl-2家族，仅含Bcl-2家族4个同源结构域(BHl-4)中的BH3结构域，而BH3域被认为是细胞凋亡起始的必需因子，可通过拮抗抗凋亡因子的作用或直接与Bax等相互作用并共同转位到线粒体膜上引起细胞色素c释放而诱导细胞凋亡。Bim在多种正常细胞中均有表达，其中包括造血细胞、上皮细胞、神经细胞及生殖细胞等。最近的研究发现，Bim基因作为抑癌基因，其表达缺失可促使多种肿瘤的发生，包括前列腺癌，乳腺癌，子宫内膜癌等。而且Bim也是许多抗肿瘤药物诱导细胞凋亡的重要介质之一。Bim基因的缺失可导致多种肿瘤的发生，其中多为造血系统肿瘤。Bim在酪氨酸激酶抑制剂诱导表皮生长因子受体突变的非小细胞肺癌细胞株凋亡过程中起重要作用，也与白血病细胞对糖皮质激素的耐药性相关，用Bim基因表达载体转染肿瘤细胞有可能成为肿瘤基因治疗的新途径。目前常用于检测Bim基因缺失的方法主要有：直接测序法、荧光原位杂交(florescenceinsituhybridization，FISH)、免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)、逆转录聚合酶链反应(reversetranscription-polymerisechainreaction，RT-PCR)。直接测序法的结果虽然具有客观性和特异性，但是它却存在检测周期长、操作过程复杂，易被污染，测序结果的判读较复杂、费时，费用较高等缺点，此外，对于检测异质性较高的临床肿瘤组织样本是，直接测序法假阴性率高。荧光原位杂交可以对染色体或特定基因的数目异常，特定片段的缺失、易位和重排进行诊断研究，但工作量大而复杂，效率较低。免疫组织化学的检测成本较低，大部分医院的病理科都可以开展，但IHC检测取决于Bim基因的表达量和相应抗体的特异性与敏感性，在未发现理想的抗体之前，IHC检测的准确性和重复性尚难保证。RT-PCR的基本原理是首先经逆转录酶作用，在特异性引物存在下，将RNA逆转录为单链的CDNA，再通过PCR将CDNA扩增，电泳后确证结果，具有敏感特异、所需组织量极少等优点，但对组织中RNA的质量有较高要求，若组织中的RNA降解严重，则可能影响最终的检测结果，且费时，检出率较低，难以在常规工作或基层实验室推广普及应用。然而现有检测方法存在无法同时兼顾适用于临床样本、检测方法简便易行、准确率高、灵敏度高、结果判定简洁快速准确的缺点。实时荧光定量PCR技术(rea1-timefluorescentquantitativePCR，FQ-PCR)于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出，它是一种在PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时，探针结合在DNA任一一条单链上；PCR扩增时，Taq酶的5’端-3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域，然而应用于BIM缺失突变的检测引物及探针或试剂盒未见报道。综上所述，为了临床上实现治疗肺癌的目标，本领域内需要开发简便易行的、准确率高、灵敏度高的检测方法和/试剂盒，尤其是适用于临床样本检测的方法和/试剂盒，以用于检测BIM缺失突变，便于指导机体的个性化治疗。
技术实现思路
为解决上述现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种基于荧光定量PCR检测Bim基因缺失突变的检测引物及探针、检测试剂盒。本专利技术的目的之一是提供一种Bim基因缺失荧光定量PCR检测引物及探针，正向引物序列为ForwardPrimer：5’-CAACAAACCCATCAGAACAGACAC-3’、反向引物序列为ReversePrimer:5’-ACAGC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种Bim基因缺失荧光定量PCR检测引物及探针，正向引物序列为Forward Primer：5’‑CAACAAACCCATCAGAACAGACAC‑3’、反向引物序列为Reverse Primer:5’‑ACAGCCTCTATGGAGAACAGTGATT‑3’，荧光探针序列为Taqman‑Probe:5’‑FAM‑CAGACACTGGAACAAA‑MGB‑3’，荧光探针的5′端标记FAM荧光报告基团，3’端标记MGB荧光淬灭基团。

【技术特征摘要】
1.一种Bim基因缺失荧光定量PCR检测引物及探针，正向引物序列为ForwardPrimer：
5’-CAACAAACCCATCAGAACAGACAC-3’、反向引物序列为ReversePrimer:5’-
ACAGCCTCTATGGAGAACAGTGATT-3’，荧光探针序列为Taqman-Probe:5’-FAM-
CAGACACTGGAACAAA-MGB-3’，荧光探针的5′端标记FAM荧光报告基团，3’端标记MGB荧光淬灭
基团。
2.权利要求1所述引物及探针在制备针对Bim基因缺失突变检测的试剂盒、芯片或其他
检测试剂中的应用。
3.一种Bim基因缺失荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求1所
述检测引物及探针。
4.根据权利要求3所述检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括阳性对照样品
A：包含所检测Bim基因缺失的基因组片断DNA质粒。
5.一种快速、准确检测Bim基因缺失的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒包括荧光定量反
应液预混液、荧光定量反应液A、阳性对照样品A；
荧光定量反应液A：检测Bim基因缺失的引物和探针序列，正向引物序列为Forward
Primer：5’-CAACAA...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟明，李香梅，
申请(专利权)人：安徽达健医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34