一种用于莱姆病免疫血清学诊断的蛋白质组合芯片及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生物医学检测领域，具体涉及一种用于莱姆病免疫血清学诊断的蛋白质组合芯片及其制备与应用。本发明专利技术的第一方面，提供了一种蛋白质组合芯片，包括固相载体和捕获分子，所述捕获分子固定于所述固相载体表面上，所述捕获分子含有伯氏疏螺旋体鞭毛蛋白（Flagellin）、伯氏疏螺旋体外膜蛋白C（OspC）以及伯氏疏螺旋体变量主要蛋白样序列表达E蛋白（VlsE）。所述蛋白质组合芯片还可含有，捕获分子VlsE IR6多肽。与传统方法相比，本发明专利技术的蛋白质组合芯片在大大提高检测阳性率的基础上，还能够非常方便地区分感染类型。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医学检测领域，具体涉及一种用于莱姆病免疫血清学诊断的蛋白质组合芯片及其制备与应用。
技术介绍
莱姆病(LymeDiseas，LD)是一种由蜱虫传播的旋体感染引起的累及皮肤、神经、关节、心脏等多组织器官损伤的疾病。莱姆病的主要病原体为伯氏疏螺旋体，主要分为三个亚型：狭义伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferisensuestricto)，嘎氏伯氏疏螺旋体(Borreliaafzelii)和伽氏伯氏疏螺旋体(Borreliagarinii)。莱姆病菌株在我国也分为三种基因型，其中B.burgdorferisensuestricto、B.afzelii、B.garinii基因种比率分别为5.81％、23.26％、66.28％。莱姆病在美国以及欧洲，尤其是斯堪的纳维亚半岛以及中欧地区为其高发地区；在中国，莱姆病的发病主要分布在山区以及林区，儿童发病率高于成人。环形游走性红斑(Erythemamigrans，EM)是莱姆病早期典型症状，未经治疗的莱姆病病人在病情发展的数月到数年之间会发生神经性病变，外周神经以及中枢神经都将受累，导致神经性莱姆病(neuroborreliosis,NB)。但是由于莱姆病感染初期的临床表现的非特异性，即其环形游走性红斑的表现与诸多皮肤性疾病有类似及重叠的表现，以及临床医生对莱姆病的危害认识不足等原因，导致莱姆病易在临床上误诊或漏诊。实验研究表明宿主动物对三种基因型伯氏疏螺旋体感染引起的临床症状有所不同，狭义伯氏疏螺旋体主要引起与关节有关的疾病，嘎氏伯氏疏螺旋体主要引起皮肤疾病，伽氏伯氏疏螺旋体主要引起与神经系统有关的疾病等。目前用于实验室诊断伯氏疏螺旋体感染的方法包括细胞培养技术、免疫组织化学技术、聚合酶链反应以及用全细胞裂解液、重组蛋白和多肽进行的酶联免疫检测或者蛋白质印迹的血清抗体检测等技术。尽管如此，常规血清免疫方法在莱姆病诊断上的价值仍然存在着诸多问题。美国国家疾控中心推荐莱姆病检测的首选方法是用ELISA或者直接免疫荧光法对血清中疏螺旋体产生的抗体的检测，但是结果仍需要免疫印迹方法的确证。
技术实现思路
为了克服现有技术中所存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种用于莱姆病免疫血清学诊断的蛋白质组合芯片及其制备与应用。为了实现上述目的以及其他相关目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供了一种蛋白质组合芯片，包括固相载体和捕获分子，所述捕获分子固定于所述固相载体表面上，所述捕获分子含有伯氏疏螺旋体鞭毛蛋白(Flagellin)、伯氏疏螺旋体外膜蛋白C(OspC)以及伯氏疏螺旋体变量主要蛋白样序列表达E蛋白(VlsE)。优选地，所述固定为点阵固定。优选地，所述固相载体为金箔芯片。本专利技术的优选实施例中所采用的金箔芯片的基底为玻璃片，其上覆盖一层10nm厚度的纯金(纯度99.9％)，金箔之上为一区域化的50μm的TEFLON膜的阵列(96孔*2，8行*12列)，阵列孔径为1.25mm。进一步优选地，所述固相载体为表面进行了DSU修饰的金箔芯片。所述DSU亦即二硫双(琥珀酰亚氨基十一酸酯)。优选地，所述固相载体表面伯氏疏螺旋体鞭毛蛋白(Flagellin)的密度范围是：6x10-4μg/mm2～0.16μg/mm2。进一步优选地，所述固相载体表面伯氏疏螺旋体鞭毛蛋白(Flagellin)的密度范围是：0.04μg/mm2～0.16μg/mm2。优选地，所述固相载体表面伯氏疏螺旋体外膜蛋白C(OspC)的密度范围是：3x10-4μg/mm2～0.16μg/mm2。进一步优选地，所述固相载体表面伯氏疏螺旋体外膜蛋白C(OspC)的密度范围是：0.04μg/mm2～0.16μg/mm2。优选地，所述固相载体表面伯氏疏螺旋体表面蛋白VlsE的密度范围是：3x10-4μg/mm2～0.16μg/mm2。进一步优选地，所述固相载体表面伯氏疏螺旋体表面蛋白VlsE的密度范围是：0.04μg/mm2～0.16μg/mm2。优选地，所述固相载体表面还固定有VlsEIR6多肽，所述VlsEIR6多肽分别是VlsEIR6多肽1、VlsEIR6多肽2、VlsEIR6多肽3。优选地，VlsEIR6多肽1的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，具体为：AAMKKDDQIAAAIALRGMAKDGKFAVK。VlsEIR6多肽2的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，具体为：AAMKKDDQIAAAMVLRGMAKDGQFALKD。VlsEIR6多肽3的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，具体为：AAMKKSDKIAAAIVLRGVAKDGKFAVA。优选地，所述蛋白质组合芯片的固相载体表面还固定有阴性对照。所述阴性对照是PBST-BSA溶液或阴性血清。所述PBST-BSA溶液是由浓度0.01M、PH7.2-7.4的磷酸缓冲液PBS；0.1％(v/v)Tween20；0.1％(w/v)胎牛血清BSA混合构成。所述阴性血清为临床确诊未感染伯氏疏螺旋体的健康人的血清。优选地，所述的蛋白质组合芯片的固相载体表面还点阵固定有阳性对照。所述的阳性对照选用人免疫球蛋白IgG、IgM或阳性血清。所述的阳性血清是临床确诊的伯氏疏螺旋体感染患者的血清。本专利技术的第二方面，提供了上述蛋白质组合芯片的构建方法，包括如下步骤：将各捕获分子分别进行稀释，获得捕获分子溶液；采用常规方法将捕获分子溶液分别点阵于固相载体表面的不同位置，并固定。本专利技术的第三方面还提供了前述蛋白质组合芯片在制备伯氏疏螺旋体检测试剂盒中的用途。本专利技术的第四方面提供了一种伯氏疏螺旋体检测试剂盒，所述试剂盒包括前述蛋白质组合芯片。组合特殊抗原和金箔芯片的选用是本专利技术蛋白质组合芯片盒的关键创新点。基于本专利技术的所述试剂盒采用的是荧光方法来进行定量检测，所以试剂盒中还可以包括其他一些试剂。例如：标准品，稀释液，清洗液中的一种或多种。具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据实际需要配置。所述标准品包括伯氏疏螺旋体鞭毛蛋白(Flagellin)、伯氏疏螺旋体外膜蛋白C(OspC)以及伯氏疏螺旋体变量主要蛋白样序列表达E蛋白(VlsE)的IgG或IgM抗体。优选地，所述的试剂盒还包括阴性对照。所述阴性对照是PBST-BSA溶液或阴性血清。所述的阴性血清为临床确诊未感染伯氏疏螺旋体的健康人血清。优选地，所述试剂盒还包括阳性对照。所述阳性对照是指临床确诊伯氏本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质组合芯片，包括固相载体和捕获分子，所述捕获分子固定于所述固相载体表面上，所述捕获分子含有伯氏疏螺旋体鞭毛蛋白(Flagellin)、伯氏疏螺旋体外膜蛋白C(OspC)以及伯氏疏螺旋体变量主要蛋白样序列表达E蛋白(VlsE)。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质组合芯片，包括固相载体和捕获分子，所述捕获分子固定于所述固相载
体表面上，所述捕获分子含有伯氏疏螺旋体鞭毛蛋白(Flagellin)、伯氏疏螺旋体外膜蛋白
C(OspC)以及伯氏疏螺旋体变量主要蛋白样序列表达E蛋白(VlsE)。
2.根据权利要求1所述的蛋白质组合芯片，其特征在于，所述固相载体为金箔芯片。
3.根据权利要求1所述的蛋白质组合芯片，其特征在于，所述固相载体为表面进行了
DSU修饰的金箔芯片。
4.根据权利要求1所述的蛋白质组合芯片，其特征在于，所述固相载体表面伯氏疏螺旋
体鞭毛蛋白(Flagellin)的密度范围是6x10-4μg/mm2～0.16μg/mm2。
5.根据权利要求1所述的蛋白质组合芯片，其特征在于，所述固相载体表面伯氏疏螺旋
体外膜蛋白C(OspC)的密度范围是3x10-4～0.16μg/mm2。
6.根据权利要求1所述的蛋白质组合芯片，其特征在于，所述固相载体表面伯氏疏螺旋
体变量主要蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜卫东，黄娜丽，叶雷，
申请(专利权)人：安徽医科大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34