黑曲霉（Aspergillus niger）An-19菌株及其用于洛伐他汀的生产的用途和发酵方法技术

本发明专利技术属于生物技术微生物领域，涉及1株液体发酵生产Lovastatin的黑曲霉（Aspergillus niger）An-19菌株、用途和发酵生产方法。黑曲霉（Aspergillus niger）An-19菌株，保藏编号为：CCTCC M 2015673，保藏地为：中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2015年11月11日。本发明专利技术所涉及的An-19菌株筛选自自然发酵的稻谷，经形态特征和18S rDNA基因序列分析，鉴定为黑曲霉（Aspergillus niger）。经培养基配方和培养条件优化后，5 L发酵罐发酵116 h，Lovastatin产量可达267.02 mg/L。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物技术微生物领域，涉及1株液体发酵生产Lovastatin的黑曲霉（Aspergillusniger）An-19菌株、用途和发酵生产方法。
技术介绍
黑曲霉（Aspergillusniger）是在自然界广泛存在的一种丝状真菌，属半知菌门、丝孢纲（Hyphomycetes）、丛梗孢目（Moniliales）、丛梗孢科（Moniliaceae）。广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中，生长适宜pH为3~7。是重要的工业发酵菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等。也是美国食品药品监督局（FDA）认定的GRAS（GenerallyRegardedAsSafe）菌株之一，在有机酸、工业酶制剂方面应用广泛。此外有些菌株还会产生具有重要应用价值的生理活性物质如Lovastatin等。1980年，Alberts等从土曲霉（Aspergillusterreus）中提取到称为洛伐他汀（Lovastatin）的化合物。Lovastatin是降血脂的他汀类药物，具有抑制体内生物合成胆固醇的关键酶-羟甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMG）的活性，可用于治疗心血管疾病。美国和日本等国家通过发酵的方式开发出一系列的Lovastatin药物，但我国对降脂曲霉的研究生产中普遍存在产量偏低、生产成本偏高等问题。究其原因主要是缺乏优良的生产菌株和适宜的发酵工艺。因而筛选出高产Lovastatin的曲霉菌株并对其发酵工艺进行优化，具有良好的理论意义和应用前景。本专利技术所筛选的黑曲霉（Aspergillusniger）An-19菌株，具有高产Lovastatin、生长速度快、培养方法简单等优良特性。在发酵培养基初始pH为5.5，培养温度为26℃条件下，An-19菌株通过液体发酵培养基和发酵条件优化后，5L发酵罐发酵116h，Lovastatin产量可达267.02mg/L。
技术实现思路
针对市场上Lovastatin需求日益增长，生产Lovastatin优良工业菌株的缺乏等的问题。本专利技术的目的是提供1株高产Lovastatin黑曲霉（Aspergillusniger）An-19菌株和发酵生产Lovastatin的方法。本专利技术所述黑曲霉（Aspergillusniger）An-19菌株，保藏编号为：CCTCCM2015673，保藏地为：中国典型培养物保藏中心，中国武汉大学。保藏日期为：2015年11月11日。黑曲霉（Aspergillusniger）An-19菌株的形态特征：PDA培养基上的菌落初期为白色绒毛状，后变成黑褐色粉粒状，15d菌落直径达60mm，有环形沟纹；显微镜观察菌丝光滑，有隔膜，直径6μm~8μm的分支状；分生孢子头丰富，黑褐色，球状，直径150μm～350μm；分生孢子梗茎长短不一，壁较薄，光滑黄褐色；顶囊膨大成球形，双层小梗；分生孢子呈褐色球形或近球形，表面粗糙，直径4~5μm×4~4.5μm。黑曲霉An-19菌株用于产生洛伐他汀（Lovastatin）的应用。黑曲霉An-19菌株的发酵培养条件为pH5.0~6.0，温度20~30℃。本专利技术所涉及的An-19菌株筛选自自然发酵的稻谷，经形态特征和18SrDNA基因序列分析，鉴定为黑曲霉（Aspergillusniger）。经培养基配方和培养条件优化后，5L发酵罐发酵116h，Lovastatin产量可达267.02mg/L。高产洛伐他汀（Lovastatin）的发酵方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：1）用接种针挑少量该菌株菌丝，转接于PDA培养基平皿中，活化培养2~4d；2）取平皿中1菌饼接种于PD培养液中，摇床培养2~4d，制得一级种子；3）在种子培养液中，按种子培养液质量2~10%加入一级种子，摇床培养1~3d成二级种子；在发酵培养基中，按发酵培养基质量10~20%接入二级种子，发酵培养时间为110h~120h。作为优选，发酵培养条件为pH5.0~6.0，温度20~30℃。作为优选，发酵培养的发酵罐搅拌桨转速200r/min，通气量120L/h，罐压0.1MPa~0.5MPa。作为优选，一级种子培养基：马铃薯20%、葡萄糖2%、牛肉膏0.5%、KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O0.1%、pH5.5~6.0。作为优选，二级种子培养基：乳糖10%、甘油1%、蛋白胨0.5%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O0.1%、NaNO30.1%、pH5.5~6.0。作为优选，发酵培养基：乳糖18%、甘油2%、蛋白胨1%、酵母膏0.5%、MgSO4·7H2O0.1%，NaNO30.2%、KH2PO40.1%、ZnSO40.2%、pH5.5。取上述制得发酵液10mL，加甲醇40mL（按1:4的比例），超声处理20min，50℃水浴2h，3000r/min离心3min，取上清液，经0.45μm滤膜过滤，HPLC法检测Lovastatin产量，可达220mg/L~270mg/L。黑曲霉（Aspergillusniger）An-19菌株5L发酵罐发酵110h~120h后，过滤发酵液，乙酸乙酯萃取菌丝中Lovastatin，与滤液混合；用远藤章教授方法提取Lovastatin，蒸干后得微黄色块状晶体；核磁共振波谱技术分析比对表明Lovastatin提取物结构与Lovastatin标准品一致。黑曲霉在食品生产中已获得了长期的实践证明，其生产和应用均不存在安全隐患，An-19菌株可用于Lovastatin的生产，是较有潜力的工业菌株。附图说明图1An-19菌株PDA培养基上培养15d菌落正面。图2An-19菌株PDA培养基上培养5d分生孢子头生长的显微特征（100X）。图3An-19菌株分生孢子头显微特征（呈球状，200X）。图4An-19菌株分生孢子显微特征（400X）。图5An-19菌株18SrDNA基因序列（1302bp）。图6基于16株曲霉属（Aspergillus）18SrDNA基因序列建立的An-19菌株系统发育树。图7An-19菌株在5L发酵罐中的生长曲线和Lovastatin产量随发酵时间变化曲线。图8An-19菌株发酵液中Lovastatin提取物外观（10X）。保藏声明黑曲霉（Aspergillusniger）An-19菌株，保藏编号为：CCTCCM2015673，保藏地为：中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2015年11月11日。具体实施方式下面对本专利技术具本文档来自技高网...

【技术保护点】
黑曲霉（Aspergillus niger）An‑19菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2015673，保藏日期为：2015年11月11日。

【技术特征摘要】
1.黑曲霉（Aspergillusniger）An-19菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，
保藏编号为：CCTCCNO:M2015673，保藏日期为：2015年11月11日。
2.权利要求1所述的黑曲霉An-19菌株用于产生洛伐他汀（Lovastatin）的应用。
3.权利要求2所述的应用，其特征在于：黑曲霉An-19菌株的发酵培养条件为pH5.0~
6.0，温度20~30℃。
4.高产洛伐他汀（Lovastatin）的发酵方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：
1）用接种针挑少量该菌株菌丝，转接于PDA培养基平皿中，活化培养2~4d；
2）取平皿中1菌饼接种于PD培养液中，摇床培养2~4d，制得一级种子；
3）在种子培养液中，按种子培养液质量2~10%加入一级种子，摇床培养1~3d成二级种
子；
4）在发酵培养基中，按发酵培养基质量10~20%接入二级种子，发酵培养时间为110h~
120h。
5.根据权利要求4所述的高产洛伐他汀的发酵...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋冬花，任浩，章婷，韩肖飞，郑婕施，
申请(专利权)人：浙江师范大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33