本发明专利技术涉及一种来自动物粪便宏基因组的多功能木聚糖降解酶及其编码基因、重组载体和重组菌株。本发明专利技术所述的多功能木聚糖降解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术的多功能木聚糖降解酶以山毛榉木聚糖为底物的最适pH为6.5，最适温度为50℃，在0℃、10℃、20℃下分别具有13.5％、46.9％、72.6％的酶活；在37℃、45℃、50℃条件下耐受60min，仍能保持95％以上活性；本发明专利技术的多功能木聚糖水解酶可广泛应用于饲料、食品和生物燃料等行业。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，尤其涉及一种动物粪便宏基因组来源的多功能木聚糖降解酶、其编码基因及其制备方法。
技术介绍
木聚糖是一个由β-1，4或β-1，3糖苷键连接的高度分支的异聚多糖，主链由木糖苷键连接吡喃木糖基而成，侧枝包括乙酰基，L型阿拉伯糖基，葡萄糖醛酸基等。与木聚糖的结构相适应，木聚糖降解酶种类丰富，完全降解木聚糖需要内切1，4-β-D-木聚糖酶(endo-l，4-β-D-xylanohydrolase，EC3.2.1.8)、β-木糖苷酶(β-D-xylosidase，EC3.2.1.37)，a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(a-L-arabinofuranosidase，EC3.2.1.55)、a-D葡萄糖醛酸苷酶(a-D-glucatronidase，EC3.2.1.139)等多种酶的协同作用，通过这些酶的协同作用，木聚糖能够有效地被水解(Collinsetal.FEMSMicrobiolRev，2005，29:3-23)。植食性动物胃肠道中存在丰富的与木质纤维素降解有关的多种酶类，但不同动物之间存在差异(Hessetal.Science，2011，331:463-467；Daietal.PLoSOne，2012，7:e40430)。研究表明，不同环境及微生物来源的木聚糖酶酶学性质差异较大(Kimuraetal.BiosciBiotechnolBiochem,2000,64:1230-1237；Gessesseetal.ApplEnvironMicrobiol,1998,64:3533-3535)，因此研究鉴定不同来源的木聚糖降解酶对拓宽其应用领域具有重要意义。胃肠道微生物群落是动物长期进化的结果，和动物的食性、机体的免疫功能、营养需求等有着密切的关系。滇金丝猴(Rhinopithecusbieti)是典型的植食性灵长类动物，主食粗纤维食物，研究发现其肠道中存在大量能分解纤维素、半纤维素的细菌，如纤维杆菌属、密螺旋属、假单胞菌属以及瘤胃球菌属的细菌(Xuetal.BMCGenomics,2015,16:174)，但其与纤维素降解相关酶的研究工作很少。微生物是获取酶的主要来源，因此分离微生物是获取酶的首要步骤，一直以来研究者多利用纯培养技术预先从环境样品中分离出能够利用纤维素的微生物，再从其体内提取相关的酶。然而，传统的微生物纯培养技术使得占微生物种类99％以上的不可培养微生物无法分离获得，因此通过分离培养微生物来筛选新型酶的传统方法大大限制了筛选的广泛性和有效性。近年发展起来的宏基因组技术避开传统的微生物分离培养过程，直接研究特定环境中的基因组DNA，借助新一代测序技术和生物信息学平台，挖掘利用大量过去无法获得的新基因资源。宏基因组技术的应用拓宽了木聚糖降解酶的筛选与克隆的范围，Gong等从奶牛瘤胃宏基因组文库中筛选得到高活性的GH10木聚糖酶(Gongetal,BMCResearchNotes,2012,1:566-576)，该酶在4℃时能保持25％的相对活性。Kim等从土壤宏基因组文库中筛选得到一种新型双功能木聚糖酶/内切葡聚糖酶CelM2，可同时水解大麦葡聚糖及木聚糖(Kimetal,BiochemBiophyResCommun,2009,383:183-186)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种动物粪便宏基因组来源的多功能木聚糖降解酶、其编码基因及其制备方法，本专利技术提供的多功能木聚糖降解酶同时具有木聚糖酶、木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶活性，且具有部分低温活性。本专利技术的目的之一在于提供一种动物粪便宏基因组来源的多功能木聚糖降解酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，共402个氨基酸，其理论分子量为47.74kDa。本专利技术从滇金丝猴粪便宏基因组中得到木聚糖降解酶基因XynRBM，并将其转入大肠杆菌进行异源表达和重组酶的酶学特性分析，发现获得的多功能木聚糖降解酶XynRBM同时具有木聚糖酶、木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶活性，且具有部分低温活性，在0℃、10℃、20℃下分别具有13.5％、46.9％、72.6％的酶活，可应用于低温产品加工，且本专利技术中的多功能木聚糖降解酶来源于动物胃肠道，因此其性质具有进一步应用于饲料等领域的潜力。本专利技术的目的之二在于提供一种编码上述技术方案所述的多功能木聚糖降解酶的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术从滇金丝猴的粪便中制备微生物宏基因组DNA，通过Hiseq基因组测序仪测序宏基因组DNA，经功能注释发现木聚糖降解酶的编码基因XynRBM，通过PCR的方法分离克隆该基因，其全长为1209bp，起始密码为ATG，终止密码为TAA。经NCBI网站的BLASTP比对发现，该木聚糖降解酶基因编码的氨基酸序列与GenBank中Treponemabryantii来源的beta-1,4-xylanase(WP_022931984.1)具有最高的一致性，为55％，但该Treponemabryantii来源的蛋白活性并未研究，说明该木聚糖降解酶XynRBM是一种新的糖苷水解酶。本专利技术的目的之三在于提供一种包含上述技术方案所述的基因的重组表达载体，优选为pEasy-E2-XynRBM。将本专利技术的基因XynRBM插入到表达载体中，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接。作为本专利技术的一个最优选的实施方案，将本发明基因和表达载体pEasy-E2通过T-A方式相连接，得到重组大肠杆菌表达质粒pEasy-E2-XynRBM。本专利技术的目的之四在于提供一种利用上述技术方案所述的重组表达载体转化宿主细胞所得的重组菌株，所述菌株包括但不限于大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21(DE3)/XynRBM。本专利技术的目的之五在于提供一种上述技术方案所述的多功能木聚糖降解酶的制备方法，包括以下步骤：将木聚糖降解酶的重组表达载体转化宿主细胞得到重组菌株，培养重组菌株，诱导重组木聚糖降解酶的表达；回收并纯化所表达的重组木聚糖降解酶，得到多功能木聚糖降解酶。其中，所述木聚糖降解酶基因按照以下方法获得：以SEQIDNO.3所示的上游引物和SEQIDNO.4所示的下游引物为引物对，以滇金丝猴粪便微生物宏基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到木聚糖降解酶基因；其中，上游引物的序列为：5’ATGAACGGAAGAACTTTAAAAAC3’；下游引物的序列为：5’AATTATAATTTCAAGCAGTTTATC3’。具体而言，所述木聚糖降解酶按照以下方法获得：首先按照以下方本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种动物粪便宏基因组来源的多功能木聚糖降解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种动物粪便宏基因组来源的多功能木聚糖降解酶，其氨基酸序列如
SEQIDNO.2所示。
2.一种编码权利要求1所述的多功能木聚糖降解酶的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.
1所示。
4.一种包含权利要求2所述的基因的重组表达载体。
5.一种利用权利要求4所述的重组表达载体转化宿主细胞所得的重组菌
株。
6.包含权利要求1所述的多功能木聚糖降解酶的酶制剂。
【专利技术属性】
技术研发人员：许波，戴利铭，黄遵锡，李俊俊，唐湘华，周峻沛，杨云娟，丁俊美，
申请(专利权)人：云南师范大学，
类型：发明
国别省市：云南;53
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