烟草Snakin2基因的新应用制造技术

本发明专利技术公开了烟草NtSnakin2蛋白和/或NtSnakin2基因在改良植物对重金属镉的耐受性或积累中的应用。通过构建NtSnakin2基因的酿酒酵母转基因超表达载体，将NtSnakin2基因在酵母中超表达，可以提高酵母对重金属镉的耐受性，并降低酵母中的镉含量，促进酵母体内镉的外排，同时该基因在酵母中的表达还可以提高酵母对过氧化氢的耐受性。该基因可应用于工程菌及植物针对体内镉含量改变的遗传工程育种，以及用于环境重金属镉污染的微生物和植物修复领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物基因工程领域，具体涉及烟草Snakin2基因及其编码蛋白的新应用。
技术介绍
重金属镉是一种植物生长非必需的毒性元素。随着环境污染越来越严重，由地壳释放到水、大气和土壤中的具有毒性的活性镉离子也越来越多。镉在土壤中易被植物吸收且经食物链富集危害人体，已成为对生态环境危害严重的重金属之一。烟草属于易富集镉的作物(富集系数5～10)，且吸收的镉主要分配积累于叶片中，烟叶中的镉可通过烟气进入人体，增加健康威胁的风险。因此，烟草的重金属安全性成为国内外烟草研究的热点。通常情况下，人体中的镉有两大来源：一是大米；二是烟草。相关研究显示，每一支香烟都含1-2微克的镉，其中约10％会被人体吸收。由种植在镉污染土壤的烟草所制的香烟对人体危害更大。2010年10月8日，第九届亚太烟草健康会议在澳大利亚悉尼召开。会议发布的一项中国与其他国家烟草的对比研究表明：中国产的13个牌子卷烟检测出含有重金属。烟草中含有的铅、砷和镉等重金属成分，其含量与加拿大产香烟相比，最高超出三倍以上。该事件被称为烟草界的“三聚氰胺事件”。2014年4月，国土资源部和环境保护部公布数据表明，我国土壤中镉超标的土地已达我国国土总面积的7％。按照污染发生的地区来看，重金属污染则主要分布于我国的华中南地区、泛珠三角地区、长三角地区及东北地区。而我国烟草分布很广，其中河南、山东、云南、甘肃、湖南五省是我国重要的烤烟产地。在华南地区，粤北矿区重金属污染严重，该地区也种植了一定面积的烟草。由此可见，我国很多烟草种植区域均发生了严重的重金属污染，而这些污染地区种植的烟草业必然会出现重金属超标的现象。通过分离烟草中的镉胁迫应答或镉解毒基因，深入探讨镉-烟草的生物化学及分子生理机制研究，并将镉胁迫应答相关基因在生物体内调控表达，可获得影响生物体内镉积累的转基因后代。该专利技术具有重要的应用价值。Snakin/GASA基因家族在植物体内广泛存在，编码一类小分子抗病及抗氧化蛋白。目前，该类基因已经在拟南芥、水稻、番茄、土豆、矮牵牛、草莓、花生、大豆等植物中均已克隆。Snakin/GASA蛋白由以下3个结构域组成：1.一个预测的含有18-29个氨基酸残基的信号肽，通常位于蛋白的N端；2.中间为一段具有成员特异性的高度可变的区域；3.以及一个C端高度保守的Snakin/GASA结构域，通常由60个氨基酸组成，其中的12个半胱氨酸残基高度保守。尽管已有的研究表明植物Snakin/GASA基因家族成员参与植物激素应答、抗病、细胞生长、清除细胞内活性氧生理生化过程，但由于并未获得该类蛋白的活性位点，其生化功能并未被明确阐述。目前，还没有报道该类蛋白能够参与重金属镉的解毒，以及影响生物体内重金属镉积累的报道。在本专利技术中，我们描述了烟草的Snakin/GASA基因NtSnakin2的表达能够影响重金属镉在生物体内的积累，提供了将该基因应用于烟草的低镉遗传育种技术的可能，本专利技术也可应用于工程菌——酿酒酵母的低镉遗传改造。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种烟草Snakin/GASA蛋白NtSnakin2及其编码基因NtSnakin2的应用。实现上述目的的技术方案如下。氨基酸序列如SEQIDNO.2的烟草Snakin/GASA蛋白NtSnakin2和/或NtSnakin2基因在提高烟草对重金属镉的耐受中的应用，所述NtSnakin2基因的cDNA为如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，或为与SEQIDNO.1互补配对的核苷酸序列，或为编码序列氨基酸序列如SEQIDNO.2的核苷酸序列。氨基酸序列如SEQIDNO.2的烟草Snakin/GASA蛋白NtSnakin2和/或NtSnakin2基因在降低烟草对重金属镉的积累中的应用，所述NtSnakin2基因的cDNA为如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，或为与SEQIDNO.1互补配对的核苷酸序列，或为编码序列氨基酸序列如SEQIDNO.2的核苷酸序列。本专利技术的烟草Snakin/GASA蛋白NtSnakin2，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，其编码基因NtSnakin2的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。应当理解，考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述编码基因的核苷酸序列进行修改，也属于本专利技术的保护范围内。本专利技术的第二个目的是公开一种酿酒酵母重组表达载体以及相应的酿酒酵母，该重组载体插入了NtSnakin2基因。将该重组载体转化进入酿酒酵母中，通过半乳糖诱导该基因在酵母中的超表达，能够在镉胁迫下，提高酵母对重金属镉的耐受，并降低酵母细胞内镉积累。同样，该基因在酵母中的表达也可以提高酵母对氧化胁迫的耐受性，提高转基因酵母对H2O2的抗性。插入有NtSnakin2基因的阅读框序列的酿酒酵母重组表达载体，所述NtSnakin2基因的cDNA为如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，或为与SEQIDNO.1互补配对的核苷酸序列，或为编码序列氨基酸序列如SEQIDNO.2的核苷酸序列。一种工程菌株酿酒酵母，其转入有上述的酿酒酵母重组表达载体。本专利技术还提供了上述酿酒酵母重组表达载体的应用。上述酿酒酵母重组表达载体在提高工程菌株酿酒酵母对重金属镉的耐受性中的应用。上述酿酒酵母重组表达载体在降低工程菌株酿酒酵母对重金属镉的积累中的应用。本专利技术的另一目的是提供一种改良烟草中重金属镉的耐受性的生物制剂。实现上述目的的技术方案如下。一种提高烟草中重金属镉耐受性的生物制剂，其活性成份来源于上述酿酒酵母重组表达载体，或其活性成份含有调控NtSnakin2基因表达的生物制品，所述NtSnakin2基因的cDNA为如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，或为与SEQIDNO.1互补配对的核苷酸序列，或为编码序列氨基酸序列如SEQIDNO.2的核苷酸序列。一种降低烟草中重金属镉积累的生物制剂，其活性成份为上述酿酒酵母重组表达载体，或其活性成份含有调控NtSnakin2基因表达的生物制品，所述NtSnakin2基因的cDNA为如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，或为与SEQIDNO.1互补配对的核苷酸序列，或为编码序列氨基酸序列如SEQIDNO.2的核苷酸序列。本专利技术的另一目的是提供一种调控烟草中重金属镉的积累的方法。实现上述目的的技术方案如下。一种调控烟草中重金属镉耐受性或重金属镉积累的方法，其步骤包括调控NtSnakin2基因的表达，所述NtSnakin2基因的cDNA为如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，或为与SEQIDNO.1互补配对的核苷酸序列，或为编码序列氨基酸序列如SEQIDNO.2的核苷酸序列。本专利技术的有益效果如下：在本专利技术中，我们通过对筛选文库获得的NtSnakin2基因的进行应用性探索，发现该基因以下应用方式：(1)该基因在酿酒酵母中的超量表达能够提高酵母对重金属镉的耐受性；(2)在酿酒酵母中的超量表达能够降低酵母细胞对重金属镉的积累，促进酵母体内镉的外排。(3)该基因在本文档来自技高网...

【技术保护点】
氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的烟草NtSnakin2蛋白和/或NtSnakin2基因在提高烟草对重金属镉的耐受中的应用，所述NtSnakin2基因的cDNA为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.1互补配对的核苷酸序列，或为编码序列氨基酸序列如SEQ ID NO.2的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的烟草NtSnakin2蛋白和/或NtSnakin2基因在提高烟
草对重金属镉的耐受中的应用，所述NtSnakin2基因的cDNA为如SEQIDNO.1所示的核苷
酸序列，或为与SEQIDNO.1互补配对的核苷酸序列，或为编码序列氨基酸序列如SEQID
NO.2的核苷酸序列。
2.氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的烟草NtSnakin2蛋白和/或NtSnakin2基因在降低烟
草对重金属镉的积累中的应用，所述NtSnakin2基因的cDNA为如SEQIDNO.1所示的核苷
酸序列，或为与SEQIDNO.1互补配对的核苷酸序列，或为编码序列氨基酸序列如SEQID
NO.2的核苷酸序列。
3.插入有NtSnakin2基因的cDNA阅读框序列的酿酒酵母重组表达载体，所述NtSnakin2
基因的cDNA为如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，或为与SEQIDNO.1互补配对的核苷酸
序列，或为编码序列氨基酸序列如SEQIDNO.2的核苷酸序列。
4.权利要求3所述的酿酒酵母重组表达载体在提高工程菌株酿酒酵母对重金属镉的耐受
性中的应用。
5.权利要求3所述的酿酒酵母重组表达载体在降低工程菌株酿酒酵母对重金属镉的积累
中的应用。
6.一种酿酒酵母工程菌株，其特征是，转化有权利要求3所述的酿酒酵母...

【专利技术属性】
技术研发人员：张美，郭艳，莫辉，
申请(专利权)人：中国科学院华南植物园，
类型：发明
国别省市：广东;44