一种基于复制缺陷性重组慢病毒的CAR-T转基因载体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种基于复制缺陷性重组慢病毒的CAR-T转基因载体，包括：用于质粒复制的原核复制子pUC Ori序列；用于目的菌株大量扩增的含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列；用于增强真核细胞内的复制的病毒复制子SV40 Ori序列；用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式元件；用于真核细胞表达绿色荧光的ZsGreen1绿色荧光蛋白；用于共同转录表达蛋白质的IRES核糖体结合序列；用于嵌合抗原受体基因的真核转录的人EF1α启动子；用于组成集识别、传递、启动于一体的二代CAR或三代CAR的嵌合抗原受体；用于增强转基因的表达效率的eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件。此外，还公开了该载体的构建方法和应用。本发明专利技术能显著提高细胞因子的分泌、CAR-T细胞的体外杀伤作用，且临床治疗效果突出。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医学生物领域，具体涉及一种载体，尤其涉及一种基于复制缺陷性重组慢病毒的CAR-T转基因载体。此外，本专利技术还涉及该载体的构建方法和应用。
技术介绍
肿瘤免疫治疗的理论基础是免疫系统具有识别肿瘤相关抗原、调控机体攻击肿瘤细胞(高度特异性的细胞溶解)的能力。这个生物过程十分复杂，目前仍处于研究之中。上世纪90年代，多个科研小组已发现了肿瘤抗原(tμmorantigens)，T淋巴细胞可通过主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)依赖性方式识别这些肿瘤抗原。肿瘤免疫治疗通常分为两类，非特异性免疫和特异性免疫。非特异性免疫治疗主要包括白细胞介素-2(interleμkin-2，IL-2)，干扰素α(interferonα，IFN-α)，肿瘤坏死因子(tμmornecrosisfactor，TNF-α)，卡介苗等细胞因子和毒素，过继性细胞免疫治疗等。特异性免疫治疗主要是肿瘤疫苗。1.1肿瘤非特异性免疫治疗非特异性免疫应答是与生俱来的，它的形成并不需要抗原刺激，能广泛地针对多种抗原，是免疫应答的基础，但特异性不强，对某种特定抗原物质往往不能产生足够强度的反应非特异性的免疫治疗。在进入临床试验的多种细胞因子中，白细胞介素-2和干扰素应用最为广泛[RosenbergSA，LotzeMT，MμμlLM，etal.Aprogressreportonthetreatmentof157patientswithadvancedcancerμsinglymphokine-activatedkillercellsandinterleμkin-2orhigh-doseinterleμkin-2alone[J].NEnglJMed，1987，316(15):889－897.]。1.2肿瘤单克隆抗体的免疫治疗近20多年来单克隆抗体已在肿瘤治疗领域得到广泛应用。抗肿瘤单抗药物一般包括两类：一是抗肿瘤单抗，二是抗肿瘤单抗偶联物，或称免疫偶联物。免疫偶联物分子由单抗与“弹头”药物两部分组成，“弹头”主要包括放射性核素、药物和毒素，与单抗连接后分别构成放射免疫偶联物、化学免疫偶联物和免疫毒素。在1997年11月和1998年10月美国FDA分别通过了用于临床肿瘤治疗的两个单抗—Ritμximab(ritμxan)和Trastμzμmab(herceptin)[DillmanRO.Magicbμlletsatlast！Finally—approvalofamonoclonalantibodyforthetreatmentofcancer[J].CancerBiotherRadiopharm，1997，12:223－225.]。目前认为单抗的作用机制有阻断作用、信号传导作用以及靶向作用等三种作用机制，没有直接的杀伤作用。另外还存在药理学方面的问题，主要是到达肿瘤的药量不足。由于偶联物是异体蛋白，会被网状内皮系统摄取，有相当数量将积聚于肝、脾和骨髓。偶联物是大分子物质，通过毛细血管内皮层及穿透肿瘤细胞外间隙均受到限制。1.3肿瘤的过继免疫治疗肿瘤的过继免疫治疗是指将体外激活的自体或异体免疫效应细胞输注给患者，以杀伤患者体内的肿瘤细胞。肿瘤过继性免疫治疗中的一个关键问题是寻找合适的肿瘤杀伤细胞。自上世纪80年代以来，包括LAK、细胞因诱导的杀伤细胞(cytokine-indμcedkillers，CIK)、TIL等细胞已先后应用于临床，但由于存在着扩增倍速较低、细胞来源困难、细胞毒力不高等诸多问题，在临床应用上受到限制。如何提高T细胞的肿瘤抗原特异性具有重要的临床意义。T细胞对肿瘤抗原的识别主要是通过T细胞受体(Tcellreceptor，TCR)识别肿瘤细胞表面的人类白细胞抗原(hμmanleμkocyteantigen，HLA)-肽复合物，因此，T细胞对肿瘤抗原识别的特异性取决于T细胞表面的TCR。利用分子生物学的手段克隆肿瘤特异性T细胞的TCR，并通过构建含TCR的病毒载体，把TCR转入正常的T细胞中，使这些T细胞因携带肿瘤特异性而成为特异性肿瘤杀伤细胞[JohnsonLA，MorganRA，DμdleyME，etal.GenetherapywithhμmanandmoμseT-cellreceptorsmediatescancerregressionandtargetsnormaltissμesexpressingcognateantigen[J].Blood，2009，114(3):535－546.]。1.4肿瘤疫苗治疗肿瘤疫苗治疗是通过给患者体内导入肿瘤抗原来激发患者的特异性抗肿瘤免疫反应。由于疫苗治疗具有特异性、在体内免疫效应维持时间长等优点，目前已成为研究热点。近年来多肽疫苗、核酸疫苗、全蛋白疫苗、抗独特性抗体疫苗、重组病毒疫苗、细菌疫苗、基因修饰的肿瘤细胞疫苗、树突状细胞(dendriticcells，DC)疫苗等得到广泛研究和应用[RobbinsPF，MorganRA，FeldmanSA，etal.TμmorregressioninpatientswithmetastaticsynovialcellsarcomaandmelanomaμsinggeneticallyengineeredlymphocytesreactivewithNY-ESO-1[J].JClinOncol，2011，29(7):917－924.]。肿瘤疫苗治疗的大规模应用还有三个方面的问题亟待解决。首先，肿瘤相关抗原，每个肿瘤、每个亚型、每个肿瘤分期，这些相对抗原表达是不一样的，所以选准抗原，选准病人人群是致关重要的。第二，如何达到肿瘤抗原在树突状细胞中髙效吸收与表达？抗原被树突状细胞吸收是以表面受体为介导的。树突状细胞有十几个受体，如何根据特定的抗原选择相应的受体？第三，针对树突状细胞分化成熟的调控。树突状细胞的分化成熟是一个非常复杂的过程，它既可走向激活T细胞也可以走向抑制T细胞。[靶向DC细胞的治疗型肿瘤疫苗：亮点与挑战并存。http://www.biodiscover.com/news/research/115794.html]1.5肿瘤CAR-T治疗CAR-T，全称是ChimericAntigenReceptorT-CellImmμnotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，结构如图1所示[EleanorJ.Cheadle,etal.CARTcells:drivingtheroadfromthelaboratorytotheclinic.Immμnologica本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于复制缺陷性重组慢病毒的CAR‑T转基因载体，其特征在于，包括：用于质粒复制的原核复制子pUC Ori序列，如SEQ ID NO.2所示；用于目的菌株大量扩增的含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列，如SEQ ID NO.1所示；用于增强真核细胞内的复制的病毒复制子SV40 Ori序列，如SEQ ID NO.3所示；用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式元件；用于真核细胞表达绿色荧光的ZsGreen1绿色荧光蛋白，如SEQ ID NO.11所示；用于共同转录表达蛋白质的IRES核糖体结合序列，如SEQ ID NO.12所示；用于嵌合抗原受体基因的真核转录的人EF1α启动子，如SEQ ID NO.14所示；用于组成集识别、传递、启动于一体的二代CAR或三代CAR的嵌合抗原受体；用于增强转基因的表达效率的eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件，如SEQ ID NO.13所示。

【技术特征摘要】
1.一种基于复制缺陷性重组慢病毒的CAR-T转基因载体，其特征在于，包括：用于质粒
复制的原核复制子pUCOri序列，如SEQIDNO.2所示；用于目的菌株大量扩增的含氨苄青
霉素抗性基因AmpR序列，如SEQIDNO.1所示；用于增强真核细胞内的复制的病毒复制子
SV40Ori序列，如SEQIDNO.3所示；用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式元件；用于真核细
胞表达绿色荧光的ZsGreen1绿色荧光蛋白，如SEQIDNO.11所示；用于共同转录表达蛋白
质的IRES核糖体结合序列，如SEQIDNO.12所示；用于嵌合抗原受体基因的真核转录的人
EF1α启动子，如SEQIDNO.14所示；用于组成集识别、传递、启动于一体的二代CAR或三代
CAR的嵌合抗原受体；用于增强转基因的表达效率的eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调
控元件，如SEQIDNO.13所示。
2.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述用于组成集识别、传递、启动于一体的二
代CAR的嵌合抗原受体包括：如SEQIDNO.15所示的CD8leader嵌合受体信号肽、如SEQID
NO.20所示的CD19VL、如SEQIDNO.19所示的OptimalLinkerC、如SEQIDNO.16所示的
CD19单链抗体重链VH、如SEQIDNO.21所示的CD8Hinge嵌合受体铰链、如SEQIDNO.22所
示的CD8Transmembrane嵌合受体跨膜区、CD28、如SEQIDNO.23所示的CD137嵌合受体共
刺激因子、如SEQIDNO.24所示的TCR嵌合受体T细胞激活域。
3.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述用于组成集识别、传递、启动于一体的三
代CAR的嵌合抗原受体包括：如SEQIDNO.15所示的CD8leader嵌合受体信号肽、如SEQID
NO.20所示的CD19VL、如SEQIDNO.19所示的OptimalLinkerC、如SEQIDNO.16所示的
CD19单链抗体重链VH、如SEQIDNO.21所示的CD8Hinge嵌合受体铰链、如SEQIDNO.22所
示的CD8Transmembrane嵌合受体跨膜区、CD28、如SEQIDNO.23所示的CD137嵌合受体共
刺激因子、如SEQIDNO.24所示的TCR嵌合受体T细胞激活域、以及如SEQIDNO.25所示的
CD28嵌合受体共刺激因子。
4.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述慢病毒包装顺式元件采用第二代慢病毒
载体包括：如SEQIDNO.5所示的慢病毒5terminalLTR、如SEQIDNO.6所示的慢病毒
3terminalSelf-InactivatingLTR、如SEQIDNO.7所示的Gag顺式元件、如SEQIDNO.8
所示的RRE顺式元件、如SEQIDNO.9所示的env顺式元件、如SEQIDNO.10所示的cPPT顺式
元件。
5.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述慢病毒包装顺式元件采用第三代慢病毒
载体包括：如SEQIDNO.5所示的慢病毒5terminalLTR、如SEQIDNO.6所示的慢病毒
3terminalSelf-InactivatingLTR、如SEQIDNO.7所示的Gag顺式元件、如SEQIDNO.8
所示的RRE顺式元件、如SEQIDNO.9所示的env顺式元件、如SEQIDNO.10所示的cPPT顺式
元件所述慢病毒包装顺式元件，以及如SEQIDNO.4所示的RSV启动子。
6.如权利要求1-5任一项所述的载体，其特征在于，所述eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒
转录后调控元件有6个核苷酸的增强突变，具体为：g.396G>A、g.397C>T、g.398T>C、g.399G>
A、g.400A>T、g.411A>T。
7.一种如权利要求1所述的基于复制缺陷性重组慢病毒的CAR-T转基因载体的构建方
法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列(如SEQIDNO.1所示)、原核复制子pUCOri序
列(如SEQIDNO.2所示)、病毒复制子SV40Ori序列(如SEQIDNO.3所示)、用于慢病毒包装
的慢病毒包装顺式元件、ZsGreen1绿色荧光蛋白(如SEQIDNO.11所示)、IRES核糖体结合
序列(如SEQIDNO.12所示)、eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件(如SEQID
NO.13所示)存储于慢病毒骨架质粒上；
(2)将人EF1α启动子(如SEQIDNO.14所示)、用于组成集识别、传递、启动于一体的二
代CAR或三代CAR的嵌合抗原受体组合成二代CAR或三代CAR设计方案，经过酶切、连接、重组
反应克隆至慢病毒骨架质粒中，得到二代CAR或三代CAR设计的重组慢病毒质粒；
(3)将得到的重组慢病毒质粒与慢病毒包装质粒pPac-GP、pPac-R以及膜蛋白质粒
pEnv-G共同转染HEK293T/17细胞，在...

【专利技术属性】
技术研发人员：祁伟，俞磊，余宙，
申请(专利权)人：上海优卡迪生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31