一种儿茶酚-O-甲基转移酶酶活力检测方法技术

本发明专利技术提供一种儿茶酚-O-甲基转移酶酶活力检测方法，该方法包括将含有儿茶酚-O-甲基转移酶的样本与S-腺苷-L-甲硫氨酸和甲基受体接触以形成S-腺苷-L-同型半胱氨酸和甲基受体的甲基化产物；通过将所述S-腺苷-L-同型半胱氨酸与S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶相接触以生成高半胱氨酸和腺苷，采用光度计评估所述腺苷的产生速率以检测所述样本中所述儿茶酚-O-甲基转移酶的酶活力。该方法具有方便、快捷和高灵敏度的特点，便于推广应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药
，同时又属于临床诊断和检测领域。具体而言，本专利技术提供了一种测定儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT，Catechol-O-methyltransferase，EC2.1.1.6)酶活力的方法。
技术介绍
儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT，Catechol-O-methyltransferase，EC2.1.1.6)，是一种重要的代谢酶，广泛存在于哺乳动物组织和红细胞中，它存在膜结合型(membrane-boundCOMT，MB-COMT)和可溶型(solubleCOMT，S-COMT)两种形式。人体内的COMT的甲基化反应作用底物是多种儿茶酚类化合物，如肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺(DA)等。在中枢神经系统中，COMT作为代谢酶将儿茶酚结构的神经递质去活；同时对儿茶酚雌激素，儿茶酚药物以及某些致癌物质也起到代谢作用。COMT是体内儿茶酚类化合物的代谢的重要酶，Val108/158Met的替换导致COMT酶活力存在多样性，其酶活力强弱与体内儿茶酚类化合物的含量有密切关系，在突触间隙特别是突触后膜上COMT的活性较高，可将S-腺苷蛋氨酸提供的甲基转移到儿茶酚胺苯环的3位氧上，成为3-甲氧基4-羟基衍生物，是具生物活性或毒性的儿茶酚胺的主要代谢酶，也是中枢神经系统外多巴胺的主要降解酶，该酶的功能与精神分裂症、帕金森病、抑郁症、儿童孤独症、焦虑症、心境障碍、强迫症等神经系统疾病有重要>的关系。儿茶酚-O-甲基转移酶功能改变将直接引起体内多巴胺及其他儿茶酚胺类物质含量的变化，儿茶酚胺特别是多巴胺系统是精神分裂症发病机制中最引人关注的生物学因素。目前已知COMT的Val108/158Met功能多态性影响精神分裂症的发生、临床特征、认知功能及治疗反应，携带低活性COMT基因型者对传统抗精神病药物的反应较差。COMT的活性测定是研究帕金森病发病机制和治疗药物研发的重要依据，可以应用COMT的抑制剂治疗中晚期的帕金森病，如恩他卡朋，该抑制剂可以使血浆左旋多巴的浓度平稳，并使左旋多巴的剂量减少，同时异动症的发生也相应减少。单双相抑郁症患者红细胞COMT平均活性浓度要低于正常人水平，这也间接证明了抑郁症的发病机制与血浆红细胞中的COMT活性浓度降低有关。也有报道说明男女患者呈现不同的COMT水平，但均异于正常人水平，对于COMT活性浓度水平的研究对研究或诊断治疗抑郁症有很重要的意义。COMT酶活性存在个体差异，其表型是由COMTH(高活性)和COMTL(低活性)两个等位基因决定的，COMT在大脑皮层前额叶神经元突触后儿茶酚胺的代谢活动中起着特别重要的作用，大脑皮层额叶功能的改变，与孤独症的核心症状之一的认知缺陷相吻合。有研究发现孤独症患者COMT基因的高活性基因型(G/G)的频率显著高于父母对照组，所以对于研究COMT基因型与孤独症发病的关联性还是非常有必要的。有研究表明焦虑症的发病与多巴胺系统的功能异常有关，对COMT基因的研究对揭示焦虑症的发病原因有重要的意义。有研究表明女性患者COMT等位基因与基因型分布均与对照有显著差异，但男性患者并无显著差异，表明COMT基因型与女性焦虑症患者的相关人格特征—高避害(harmavoidance，HA)可能存在一定的相关性。雌激素代谢产物儿茶酚雌激素(catecholestrogen，CE)可直接引起机体DNA的损伤和突变，从而诱发癌症。在肝外组织中，雌激素的代谢是通过COMT完成的。CE在COMT的作用下形成可溶于水的代谢产物排出体外，减少由于CE堆积对组织局部产生的刺激作用。如果COMT含量不足或活性降低，CE即可被细胞色素P450(cytochromeP450，CYP450)酶催化形成相应的醌类化合物，与DNA结合发生脱嘌呤反应形成脱嘌呤化合物，这种脱嘌呤作用可促使机体DNA损伤和突变，进一步引起肿瘤发生。有研究报道通过对子宫内膜癌、子宫内膜增生及正常子宫内膜的研究发现，携带COMTVal/Val基因型的妇女相对于COMTMet/Met基因型者发生子宫内膜癌的风险可能会降低，COMT基因多态性与子宫内膜癌的发病风险由关，且子宫内膜癌组织中S-COMT和MB-COMT蛋白的表达水平明显低于对照组，但对外周血S-COMT活性的研究显示并无明显差异，有可能子宫内膜癌患者体内的COMT活性变化体现在子宫内膜病变局部的活性降低。另外在乳腺癌的研究中发现，乳腺癌患者中COMT的活性要低于对照组，这对诊断以及治疗子宫内膜癌及乳腺癌都有显著的意义。目前COMT酶活力检测的方法主要有以下几种，主要检测方法是用HPLC的方法进行检测，其原理是以3,4-二羟基苯甲酸(DBA)为底物，S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，在镁离子的存在下，将SAM上得的甲基转移至DBA的3位氧上，生成产物4-羟基-3-甲氧基苯甲酸(4-OH-3-MBA)，采用HPLC对该反应的生成物进行定量测定。另一种是放射化学法。放射化学法测定COMT活性的是以14C标记的S-甲基14C-腺苷-甲硫氨酸(14-SAM)为标记甲基的供者。还有是采用气相色谱法检测。综合上述几种检测方法来看，放射法的前期处理较复杂，对技术要求较高且易造成污染，而气相色谱法和HPLC法对设备要求较高，操作相对复杂，检测周期也较长；上述两种方法的特点均不利于推广使用。
技术实现思路
因此，基于上述已有技术的缺陷，为了解决现有儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT，Catechol-O-methyltransferase，EC2.1.1.6)的酶活力检测方法不易推广的问题，本专利技术的目的是提供一种快速、特异、准确可靠的COMT酶活力检测方法。采用该方法可以在半自动或全自动的分析检测设备上使用，而且检测灵敏度高，特异性高，操作简便，因而可以得到切实的推广使用。针对上述专利技术目的，本专利技术是通过下述技术方案实现的：本专利技术提供一种儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)酶活力检测方法，所述方法包括：(1)将含COMT的样本与S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)和甲基受体接触以形成S-腺苷-L-同型半胱氨酸(SAH)和甲基受体的甲基化产物，(2)通过将所述SAH与S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶(SAHase)相接触以生成高半胱氨酸(Hcy)和腺苷(Ado)，采用光度计评估所述Ado的产生速率以检测所述样本中所述COMT的酶活力。优选地，根据前述的儿茶酚-O-甲基转移酶酶活力本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种儿茶酚‑O‑甲基转移酶酶活力检测方法，其特征在于，所述方法包括：(1)将含儿茶酚‑O‑甲基转移酶的样本与S‑腺苷‑L‑甲硫氨酸和甲基受体接触以形成S‑腺苷‑L‑同型半胱氨酸和甲基受体的甲基化产物；(2)通过将所述S‑腺苷‑L‑同型半胱氨酸与S‑腺苷‑L‑同型半胱氨酸水解酶相接触以生成高半胱氨酸和腺苷，采用光度计评估所述腺苷的产生速率以检测所述样本中所述儿茶酚‑O‑甲基转移酶的酶活力。

【技术特征摘要】
1.一种儿茶酚-O-甲基转移酶酶活力检测方法，其特征在于，所述方法
包括：
(1)将含儿茶酚-O-甲基转移酶的样本与S-腺苷-L-甲硫氨酸和甲基受
体接触以形成S-腺苷-L-同型半胱氨酸和甲基受体的甲基化产物；
(2)通过将所述S-腺苷-L-同型半胱氨酸与S-腺苷-L-同型半胱氨酸水
解酶相接触以生成高半胱氨酸和腺苷，采用光度计评估所述腺苷的产生速
率以检测所述样本中所述儿茶酚-O-甲基转移酶的酶活力。
2.根据权利要求1所述的儿茶酚-O-甲基转移酶酶活力检测方法，其特
征在于，所述甲基受体为儿茶酚类化合物；
优选地，所述儿茶酚类化合物为儿茶酚胺苯甲酸；
最优选地，所述儿茶酚苯甲酸为3,4-二羟基苯甲酸。
3.根据权利要求2所述的儿茶酚-O-甲基转移酶酶活力检测方法，其特
征在于，所述方法包括：
(1)所述含儿茶酚-O-甲基转移酶的样本、所述S-腺苷-L-甲硫氨酸和
所述甲基受体混合并反应获得反应液1；
(2)向步骤(1)中的所述反应液1加入所述S-腺苷-L-同型半胱氨酸
水解酶并反应，获得反应液2；
(3)将步骤(2)中所述的反应液2离心获得上清液；
(4)采用光度计检测步骤(3)中所述的上清液的光吸收值，间接或
直接地评估所述腺苷的产生速率以检测所述样本中所述儿茶酚-O-甲基转
移酶的酶活力。
4.根据权利要求3所述的儿茶酚-O-甲基转移酶酶活力检测方法，其特
征在于，所述方法包括：在步骤(1)过程和步骤(2)过程中加入缓冲液；
优选地，所述缓冲液选自甘氨酸/氢氧化钠、柠檬酸/柠檬酸钠、磷酸氢盐/
柠檬酸(盐)、磷酸盐、2-吗啉代乙磺酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、4-
羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、Tris-盐酸、硼酸-硼砂和巴比妥钠-盐酸缓冲液中
的一种或多种；
最优选为Tris-盐酸。
5.根据权利要求4所述的儿茶酚-O-甲基转移酶酶活力检测方法，其特

\t征在于：
所述缓冲液10～1000mmol/L，优选为25～100mmol/L，最优...

【专利技术属性】
技术研发人员：王天泽，菅晓勇，
申请(专利权)人：北京中科唯新生物医学研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11