本发明专利技术公开一种适用于植物全蛋白提取液的GSTs活性分析方法，以植物叶片和根的全蛋白提取液为样品，同时以提取液为对照样，以GSH和CDNB为反应底物，通过测定GS-CDNB偶联产物的量分析GSTs的活性。改进后的方法将CDNB的溶剂由乙醇改为丙酮，大大提高了CDNB的溶解性，在同样CDNB浓度下降低了溶剂的使用量，从而避免了由过量溶剂引起的蛋白变性；同时，改进后的方法增加了谷胱甘肽（GSH）与CDNB的摩尔比，使其更有利于分析GSTs蛋白含量较低的植物全蛋白提取液。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物化学
，具体涉及一种植物全蛋白提取液的GSTs活性分析方法。
技术介绍
谷胱甘肽转移酶(GSTs)具有多种催化活性：可以将还原型谷胱甘肽(GSH)共价偶联到含有亲电子碳、氮、硫原子的非极性化合物上，从而使GSTs做为中心元件参与到药物、农药及其它异源物质的代谢去毒过程；GSTs还可以催化还原一些氧化胁迫的代谢产物，如过氧化物等，从而使得GSTs在防御病菌侵染和非生物胁迫中发挥重要的作用。因此，在很多植物研究中都将GSTs活性作为一个重要指标来评价植株的生长状态和胁迫反应特性。GSTs活性的分析方法以CDNB偶联活性的分析为主，目前文献上的一些方法在CDNB和GSH使用量上的差异较大，且CDNB多是溶于乙醇或乙醇/水溶液中。事实上CDNB在乙醇中的溶解度较低，更难溶于乙醇/水溶液中，因此有些文献中CDNB的使用量实际上是较难达到的，且乙醇加多会引起蛋白变性；另外高CDNB和GSH含量时本底反应较高，会掩盖酶催化反应；还有一些方法需要对全蛋白提取液进行进一步的操作以提高GSTs的蛋白含量。这些方法在实验中的实际操作性较低。本专利技术在现有分析方法的基础上，通过反复实验，确定了一个适用于植物全蛋白提取液的CDNB偶联活性分析方法。
技术实现思路
本专利技术提供的一种适用于植物全蛋白提取液的GSTs活性分析方法，该方法通过反复实验，选择适用于植物全蛋白提取液的CDNB偶联活性分析方法实现的。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：一种适用于植物全蛋白提取液的GSTs活性分析方法，以烟草叶片或根的全蛋白提取液为样品，同时以提取液为对照样，以GSH和CDNB为反应底物，通过测定GS-CDNB偶联产物的量分析GSTs的活性。所述全蛋白提取液为非变性提取液。所述GSTs活性分析方法的反应体系，按顺序在一个比色皿中依次加入50～200μl提取的全蛋白、1～4μlGSH和0.1～0.4μlCDNB，并加入缓冲液至100～400μl。所述CDNB用丙酮溶解，浓度为0.1-1.5M。所述反应体系中GSH与CDNB的摩尔浓度比大于2。所述GSH用全蛋提取液溶解，浓度为40mM-200mM。所述植物全蛋白提取液的GSTs活性分析方法，作为筛选高GSTs活性优良植株、除草剂的应用。本专利技术的有益效果：改进后的方法将CDNB的溶剂由乙醇改为丙酮，大大提高了CDNB的溶解性，在同样CDNB浓度下降低了溶剂的使用量，从而避免了由过量溶剂引起的蛋白变性；同时，改进后的方法增加了谷胱甘肽(GSH)与CDNB的摩尔比，使其更有利于分析GSTs蛋白含量较低的植物全蛋白提取液。附图说明图1为烟草幼苗根和叶片的GSTs活性；图2为不同品种玉米叶片的GSTs活性；图3为不同品种玉米根的GSTs活性；图4为不同农药对烟草根中GSTs活性的影响；图5为不同农药对烟草叶片中GSTs活性的影响。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件。实施例1比较烟草根和叶片GSTs活性分析方法的应用试剂的配制：称取0.20255克CDNB(分子量为202.55)溶于1ml丙酮，配成1MCDNB溶液，冻存于-20℃；称取0.61466克还原型谷胱甘肽(GSH，分子量为307.33)溶于10ml提取液中，配成200mMGSH溶液，每份1ml冻存于-20℃，用前取出一份于冰上融化。材料的准备：以生长至6叶龄的烟草叶片和根为材料，采集完全展开的第三、四位叶片，称重后使用；用清水洗净根部的土壤，滤纸吸干水分，称重待用。全蛋白提取液(粗提液)的制备：使用pH为7.5的磷酸缓冲液(不含尿素)按照1：3(w/v)的比例加入烟草叶片或根中，冰浴研磨至匀浆，14000×g、4℃离心15min，上清即为烟草叶片或根的全蛋白粗提液，冰浴放置。酶活性检测：预热酶标仪(型号为MDSPECTRAmaxplus384)，设定测试温度为37℃，设定波长为340nm，测定时间为5min，间隔15秒读数一次，第一次读数前振荡混匀5秒，每个样品设三个重复，在96孔酶标板(Nunc475094)上按照空白对照、叶片全蛋白粗提液、根全蛋白粗提液的顺序依次加入100μl的样品，按照10个反应的量，配置反应液：在10ml离心管中依次加入978μl磷酸缓冲液、24μl融化的GSH溶液、1μlCDNB溶液，马上摇动混匀，每个样品中加入100μl反应液，放入酶标仪进行测试。结果分析：本次实验所使用的GSH与CDNB的摩尔比为4.8:1，这是由于蛋白粗提液中的成分复杂，可与GSH作用的蛋白较多，因此高的GSH/CDNB摩尔比可以保证有足够的GSH与GSTs结合用于CDNB的偶联反应。本次实验的酶标仪测试结果见表1，可见每个样品三次重复的一致性较好；反应伊始加入蛋白粗提液的光吸收值显著高于对照，说明粗提液的基质效应较高，因此蛋白粗提液的加入量不应太高，尤其是使用比色杯进行测定时，否则会导致光吸收值超出仪器的量程；表1.CDNB偶联分析中各反应池在340nm处的光吸收值注：-1、-2、-3为同一样品的实验重复序号连续监测340nm下5min内的光吸收变化值，使用1～5min内的数值，计算ΔA340/min。根据测试结果使用开始(0min)和2min时的光吸收值计算ΔA340/min，将每个样品三次重复的数据进行平均得到：ΔA340/min(根)＝0.01045；ΔA340/min(叶)＝0.0076；ΔA340/min(对照)＝0.0065；按照活性计算公式，计算根和叶片全蛋白提取液的GSTs活性，结果如图1所示，烟草根中的GSTs活性要明显大于叶片中的GSTs活性。活性计算步骤如下：活性(μmol/min/ml·粗提液)＝[ΔA340/min(样品)-ΔA340/min(空白对照)]×Vrea(ml)/ε(mM-1cm-1)/Venz(ml)×1000；其中，Vrea为反应总体积，Venz为加入的粗提液体积，ε为消光系数(1cm光径比色杯的消光系数为9.6，96孔板200μl反应体系的消光系数为5.3)。活性单位为每ml全蛋白粗提液每分钟催化产生的GS-CDNB偶联产物的μmol数。实施例2GSTs活性分析方法在筛选高GSTs优良植株中的应用分别以东农248、东农9702、东农晚粘、东甜3号玉米品种的叶片和根为样品，同时以提取液为对照样，以GSH和CDNB为反应底物，测定GS-CDNB偶联产物的量分析GSTs的活性。具体步骤如下：试剂配制参考实施例1。材料的准备：将几种玉米种子播于水培育苗盘中，待长至3叶龄时，收集全部叶片称重备用；将根部剪下在清水中冲洗3遍，用滤纸吸干后称重。全蛋白粗提液的制备参本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种适用于植物全蛋白提取液的GSTs活性分析方法，以植物叶片和根的全蛋白提取液为样品，同时以提取液为对照样，其特征在于：以GSH和CDNB为反应底物，通过测定GS‑CDNB偶联产物的量分析GSTs的活性。
【技术特征摘要】
1.一种适用于植物全蛋白提取液的GSTs活性分析方法，以植物叶片和根的全蛋白提取液为样品，同时以提取液为对照样，其特征在于：以GSH和CDNB为反应底物，通过测定GS-CDNB偶联产物的量分析GSTs的活性。
2.如权利要求1所述的适用于植物全蛋白提取液的GSTs活性分析方法，其特征在于：所述全蛋白提取液为非变性提取液。
3.如权利要求1所述的适用于植物全蛋白提取液的GSTs活性分析方法，其特征在于：所述GSTs活性分析方法的反应体系，按顺序在一个比色皿中依次加入50~200μl提取的全蛋白、1~4μlGSH和0.1~0.4μlCDNB，并加入缓...
【专利技术属性】
技术研发人员：周会娜，陈霞，翟妞，刘萍萍，陈千思，郑庆霞，张慧，徐国云，林福呈，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，
类型：发明
国别省市：河南;41
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