一种福寿螺抗逆相关基因海藻糖合成酶基因、其编码的蛋白质及其克隆方法技术

本发明专利技术公开了一种福寿螺抗逆相关基因海藻糖合成酶基因(Trehalose-6-phosphate synthase,TPS)、其编码的蛋白质及其克隆方法，属于生物技术领域。本发明专利技术还公开了这种海藻糖合成酶基因的用途，尤其是在福寿类入侵过程中提高福寿螺的低温耐受性.本发明专利技术的蛋白及其编码基因对于外来入侵生物福寿螺抗逆机制的研究具有重要的理论及实际意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及属于淡水软体动物生物
，尤其涉及一种福寿螺抗逆相关基因海藻糖合成酶基因、其编码的蛋白质及其克隆方法。
技术介绍
福寿螺(Pomacea)又名大瓶螺、苹果螺，是国际性的恶性有害生物。该螺原产于南美洲亚马逊河流域，上世纪80年代初期引入亚洲，因管理不善和口味不佳被弃养；福寿螺迅速扩散到田间，部分地区泛滥成灾，对水稻、茭白等水生作物造成严重的危害。福寿螺具有极强的繁殖力，扩散和蔓延速度快，目前已成为长江以南大部分省区的严重农业有害生物。现今福寿螺已广泛分布在我国北纬30°以南的大部分省区，包括浙江、福建、广东、海南、广西、云南、贵州、湖南、江西、重庆、四川、安徽省等，种群密度十分巨大，对农业生产造成严重影响。在入侵过程中，由于入侵地周围环境条件的变化，福寿螺会遭受不同的逆境胁迫(如高温、冷冻、干燥、高渗透压及氧化作用等)。为了对抗这些逆境胁迫，生物在进化过程中逐步形成了一些巧妙的保护机制，以维持它们的生态适应性或者保证它们能够在不利条件下生存下来。福寿螺为了适应环境变化而面对逆境会发生不同的反应，通常是通过基因表达的重建而改变其生理状态，包括分子伴侣(molecularchaperones)的合成和应激蛋白的合成，如热激蛋白(Heatshockprotein,Hsp),冷休克蛋白(Coldshockprotein,Csp)和抗冻蛋白(Antifreezeprotein,AFP)等，或者是改变酶活性、蛋白质和膜结构状态。在极端环境条件下生物除了合成新的蛋白质外，大多数生物还能通过体内调节合成一些低分子量共存的溶解物(如海藻糖和甘露醇等)以抵御外界环境对自身的伤害，这些小分子量物质能维持生物膜的完整性、蛋白质的稳定性和生物活性，起到调节渗透压的作用。海藻糖是这类低分子量共存的溶解物的典型代表，细胞内的海藻糖具有在胁迫环境(如高温、冷冻、干燥脱水或高渗透压等)中防止蛋白质聚集和帮助蛋白质正确折叠的功能，从而稳定细胞膜和蛋白质的结构使细胞保持活力。海藻糖作为生物对抗环境胁迫的重要应激保护物质，在不同的生物体中存在多种不同的合成和分解代谢途径，其相关基因被相继克隆和分析。海藻糖的合成、分解及其调控是生物抗逆的重要机制，其相关基因的研究也是海藻糖生物工程的重要基础。海藻糖既是一种贮藏性糖类，又是应激代谢的重要产物，广泛存在于细菌、酵母、丝状真菌、植物、昆虫、无脊椎动物等生物体体内。海藻糖对生物体具有非常重要的生物学意义,它是能源和碳源的储备物,是蛋白质和生物膜分子在脱水、高温、氧自由基、低温等恶劣环境中的稳定剂和保护剂,是信号传感复合物和生长调控因子,还是某些细菌细胞壁的组分之一。迄今已发现至少5种不同的海藻糖合成途径,分别为TPS/TPP途径、TreS途径、TreY/TreZ途径、TreP途径和TreT途径。5种合成途径中,TPS/TPP途径在自然界中分布最为广泛,在真核生物、真细菌和古生菌中都有发现途径应用最为广泛。海藻糖合成酶(Trehalose-6-phosphatesynthase,TPS)是海藻糖合成的限速酶。目前，已有多种昆虫的海藻糖合成酶基因(TPS)被克隆，如埃及斑蚊Aedesaegypti(XM_001657763)、甜菜夜蛾Spodopteraexigua(EF051258)、果蝇Drosophilamelanogaster(NM_134983)、棉铃虫Helicoverpaarmigera(DQ086235)、虐蚊Anophelesgambiae(EAA12459)等，但是对其功能的研究还相对较少。最近，很多生物学家致力于开发海藻糖合成酶及海藻糖酶抑制剂的新型农药，试图通过阻断生物体内海藻糖的分解和合成来达到控制害虫和杀菌的目的。福寿螺在全国各中、低纬度均有广阔分布的重要原因是与其对温度的耐受能力分不开的,这也是福寿螺在新生境能够成功定殖的重要原因。Wada(2011)发现，未经冷驯化的福寿螺在0℃下存活2d的概率不到50％，0℃下处理5d螺全部死亡；而经过冷驯化后，超过65％的福寿螺在0℃下能存活5d以上。福寿螺的耐寒性具有季节性规律，夏季的福寿螺无法在0℃下存活5d，但冬季的螺在同样处理下存活率将近100％，说明福寿螺具有低温适应机制(Wada，2007)。我们前期的研究也发现，在6～15℃范围内，15℃时福寿螺幼螺存活率最高，达100％；12℃时存活率下降至63％；9℃时绝大部分幼螺死亡，存活率仅为7％；6℃时无一存活，生存时间最短为2天，最长也仅7天，平均生存时间为4.10±0.24天。此外，6℃、9℃时的LT50分别为4天和24天。结果表明，不同低温对幼螺生存时间的影响差异极显著(x2＝193.31，df＝3，P<0.001)，其寿命随温度的降低而变短。也有报道表明，福寿螺在0℃下能够存活15～20d，-3℃下能够存活2d，-6℃条件下能存活6h(Mochida，1991)，这可能与其地理种群的分化有关(董胜张等，2010)。赵本良等(2012)首次证实了入侵我国华南地区的福寿螺的过冷却点存在，平均在-7℃左右。福寿螺的这种过冷却防御机制有利于其适应低温环境，存在着进一步向北扩散的生态风险(Matsukuraetal.，2009)。虽然有关海藻糖合成酶基因的研究已经比较多，大量编码海藻糖合成酶酶的cDNA序列也得到了克隆，但是福寿螺作为一种世界性的外来入侵生物，有关福寿螺中海藻糖的功能和作用目前尚无相关研究报道。通过本专利技术获得的福寿螺海藻糖合成酶基因，能为拓展水生软体动物生理相关基因和功能的研究奠定基础，更为有效控制福寿螺扩散危害提供理论依据和实践参考。
技术实现思路
本专利技术的目的解决现有技术中存在的问题，并提供一种福寿螺抗逆相关基因海藻糖合成酶基因、其编码的蛋白质及其克隆方法。该基因名称为PcTPS。具体技术方案如下：一种福寿螺抗逆相关基因海藻糖合成酶基因，该基因具有(i)或(ii)所述核苷酸序列之一：(i)序列表中的SEQIDNO:2或者其N-端缺失3-150个核苷酸残基且具有相同开放阅读框的DNA序列；(ii)与(i)限定的DNA序列具有90％-95％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。本专利技术的另一目的在于提供一种福寿螺抗逆相关基因海藻糖合成酶基因编码的蛋白质，该蛋白质具有(i)或(ii)所述氨基酸序列之一:(i)具有序列表中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种福寿螺抗逆相关基因海藻糖合成酶基因，其特征在于，该基因具有(i)或(ii)所述核苷酸序列之一：(i)序列表中的SEQ ID NO:2或者其N‑端缺失3‑150个核苷酸残基且具有相同开放阅读框的DNA序列；(ii)与(i)限定的DNA序列具有90％‑95％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

【技术特征摘要】
2016.01.29 CN 20161006447371.一种福寿螺抗逆相关基因海藻糖合成酶基因，其特征在于，该
基因具有(i)或(ii)所述核苷酸序列之一：
(i)序列表中的SEQIDNO:2或者其N-端缺失3-150个核苷酸残
基且具有相同开放阅读框的DNA序列；
(ii)与(i)限定的DNA序列具有90％-95％以上同源性且编码
相同功能蛋白质的DNA序列。
2.一种福寿螺抗逆相关基因海藻糖合成酶基因编码的蛋白质，其
特征在于，该蛋白质具有(i)或(ii)所述氨基酸序列之一:
(i)具有序列表中SEQIDNO：1或其N-端缺失1至50个氨基
酸残基的氨基酸序列；
(ii)在(i)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加1至23
个氨基酸且具有调控淡水软体动物抗逆性功能的由(i)衍生的蛋白
质。
3.一种如权利要求1所述基因的克隆方法，其特征在于，包括如
下步骤：
1)取新鲜福寿螺肌肉组织50mg-100mg用DEPC水冲洗3-5次，
迅速置于液氮中保存；
2)福寿螺肌肉...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘光富，俞晓平，张蓬军，申屠旭萍，许益鹏，杨倩倩，郝培应，
申请(专利权)人：中国计量学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33