可溶性埃博拉病毒包膜蛋白疫苗的制备方法及其用途。本发明专利技术公开了一种可溶性埃博拉病毒包膜蛋白疫苗的制备方法，具体为在埃博拉病毒包膜蛋白第629位氨基酸后插入两个凝血酶切割位点（GSGLVPRGSGLVPRGS），在293细胞、CHO细胞或huh7细胞中表达该重组蛋白，然后用凝血酶切割细胞膜上外侧的埃博拉病毒包膜蛋白，收集上清，抗体亲合力纯化。纯化后的蛋白可以用来制备纯蛋白性质的埃博拉病毒疫苗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病毒疫苗制备技术和医学生物技术研究领域。本专利技术涉及重组的埃博拉病毒包膜蛋白（GP蛋白）的序列组成及其在疾病预防中的使用。
技术介绍
埃博拉病毒（Ebolavirus）是引起人类和灵长类动物发生埃博拉出血热的致病病毒，它是当今世界上最致命的出血热病毒，感染者症状为恶心、呕吐、腹泻、肤色改变、全身酸痛、体内出血、发热等，其致死率达50～70％，致死原因主要为中风、心肌梗塞、低血容量休克或多发性器官衰竭。自1976年首次被发现以来，埃博拉出血热已多次在非洲多个国家和地区暴发流行，造成严重的公共卫生事件。2013年起，埃博拉病毒感染病例相继出现在几内亚、利比里亚、塞拉利昂等西非国家，且以惊人的速度传播。截至2014年12月15日，世界卫生组织宣布埃博拉病毒已在全球范围内造成6841人死亡，受感染的病例总数达到18464人，成为有史以来最大的一次埃博拉疫情。尽管埃博拉属于地区局域性流行病，但是各国都将它做为头号防御对象，一旦传入该国，会影响到该国与其它国家的经贸往来和旅游。埃博拉在任何地方大范围传播，都会酿成一场人道灾难，即使只有少数病例，也会在这个严重依赖贸易的地区引发经济动荡。疫苗是预防埃博拉病毒的最好策略。2015年1月欧盟投入逾2亿欧元推动埃博拉疫苗研究。埃博拉病毒具有一个独特和唯一的包膜蛋白（envelopeglycoprotein，GP），这个GP蛋白具有免疫原性，免疫小鼠后能够产生抗体中和埃博拉病毒。目前研发的各种埃博拉病毒疫苗均是针对GP蛋白的。目前，进入临床试验的埃博拉病毒疫苗主要有两种：一种是减毒水疱性口炎病毒载体的埃博拉疫苗“rVSVΔG-EBOVGP”，另一种复制缺陷型3型腺病毒载体的埃博拉疫苗“cAd3-EBOV”。这两种疫苗均为活的病毒疫苗，注射人体后，通过疫苗所表达的GP蛋白来激活人体的免疫系统，从而产生中和埃博拉病毒的抗体。然而，以病毒为载体的疫苗在注射人体后，会产生一过性发热和肌肉疼痛等不适症状。瑞士日内瓦大学医院2014年12月11日宣布暂停试验德国默克公司(Merck)和美国纽琳公司(NewLink)联手研发的埃博拉疫苗，源于4名接种疫苗的志愿者出现了关节疼痛症状。能否用单纯的GP蛋白来制备疫苗？这在目前的技术上存在一定的难度。这是因为GP蛋白在胞内先是翻译成完整的676个氨基酸大蛋白，随后被胞内furin酶于501位氨基酸后切割成两个蛋白：GP1和GP2。GP2蛋白为穿膜蛋白，锚定在细胞膜上，而GP1蛋白通过二硫键与GP2蛋白相链接形成复合体。同时，三个GP1/GP2蛋白复合体相互结合形成trimer，构成了埃博拉病毒包膜上的刺突结构。因此，从上可以看出，GP蛋白为非分泌性蛋白，结构复杂，需依赖于细胞膜才能正确组装。
技术实现思路
本专利技术是在埃博拉病毒包膜蛋白第629位氨基酸后插入两个凝血酶切割位点Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser（LVPRGS），即在第629位氨基酸后插入的序列具体为GSGLVPRGSGLVPRGS，重组后的埃博拉病毒包膜蛋白完整的氨基酸数目为692个(SEQIDNO：1)，完整的重组蛋白的具体序列为：MGVTGILQLPRDRFKRTSFFLWVIILFQRTFSIPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSST60NQLRSVGLNLEGNGVATDVPSATKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSE120CLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGV180VAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLT240YVQLESRFTPQFLLQLNETIYTSGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRK300IRSEELSFTVVSNGAKNISGQSPARTSSDPGTNTTTEDHKIMASENSSAMVQVHSQGREA360AVSHLTTLATISTSPQSLTTKPGPDNSTHNTPVYKLDISEATQVEQHHRRTDNDSTASDT420PSATTAAGPPKAENTNTSKSTDFLDPATTTSPQNHSETAGNNNTHHQDTGEESASSGKLG480LITNTIAGVAGLITGGRRTRREAIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAE540GIYIEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATTELRTFSILNRKAIDFLLQRWGGT600CHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDGSGLVPRGSGLVPRGSFVDKTLPDQGDNDNW660WTGWRQWIPAGIGVTGVIIAVIALFCICKFVF692该重组埃博拉病毒包膜蛋白通过基因转染入宿主细胞（可以是293细胞、huh7细胞或CHO细胞），表达后的重组蛋白依然是位于细胞膜的外侧。随后，在细胞上清中加入凝血酶，用凝血酶切割细胞膜外侧上的埃博拉病毒包膜蛋白，收集上清，抗体亲合力纯化该膜外段蛋白。上述的凝血酶切割位点也可以更改为肠激酶切割位点或Xa因子切割位点。这样的话，在埃博拉病毒包膜蛋白第629位氨基酸后插入的切割位点是肠激酶切割位点或Xa因子切割位点。纯化后的可溶性埃博拉病毒包膜蛋白，其用途是制备纯蛋白性质的埃博拉病毒疫苗。附图说明图1.插入两个凝血酶切割位点后的重组埃博拉病毒包膜蛋白结构示意图。图2.重组后的埃博拉病毒包膜蛋白在huh7细胞膜上的表达，一抗使用的是多克隆小鼠抗GP蛋白抗体，二抗使用的FITC标记的羊抗小鼠多抗。图3.DAPI染色细胞核－重组后的埃博拉病毒包膜蛋白在huh7细胞膜上的表达。图4.纯化后的可溶性埃博拉病毒包膜蛋白经8％非变性胶电泳并转膜，使用多克隆小鼠抗GP蛋白抗体进行膜上显影。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种可溶性埃博拉病毒包膜蛋白疫苗的制备方法，其特征为在埃博拉病毒包膜蛋白第629位氨基酸后插入两个凝血酶切割位点（GSGLVPRGSGLVPRGS），重组后的埃博拉病毒包膜蛋白的氨基酸数目为692个(SEQ ID NO ：1)。
【技术特征摘要】
1.一种可溶性埃博拉病毒包膜蛋白疫苗的制备方法，其特征为在埃博拉病毒包膜蛋白第629位氨基酸后插入两个凝血酶切割位点（GSGLVPRGSGLVPRGS），重组后的埃博拉病毒包膜蛋白的氨基酸数目为692个(SEQIDNO：1)。
2.根据权利要求1所述的重组蛋白，该重组埃博拉病毒包膜蛋白表达的宿主细胞可以是293细胞、huh7...
【专利技术属性】
技术研发人员：李小彦，
申请(专利权)人：李小彦，
类型：发明
国别省市：江苏;32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。