本发明专利技术公开了检测人类BRCA1和BRCA2基因突变的引物、试剂盒及方法。其上游引物为SEQ ID NO:1,3,5,7,9-193所示序列，同时其5’端加上通用引物Tag1；下游引物为SEQ ID NO:2,4,6,8,10-194所示序列，同时其5’端加上通用引物Tag2；还包括带有P5序列和SEQ ID NO:221-236所示序列的上游引物；带有P7序列和SEQ ID NO:197-220所示序列的下游引物。能快速、准确、简便地检测BRCA1和BRCA2基因全外显子及其与内含子连接区和非翻译区和启动子区突变。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，尤其涉及检测人类BRCA1和BRCA2基因突变的引物、试剂盒及方法。
技术介绍
乳腺癌和卵巢癌是女性常见恶性肿瘤，一般人群中女性在其一生中罹患乳腺癌和卵巢癌的风险分别为13％和1.5％，我国近年来乳腺癌发病率高居女性恶性肿瘤的首位，并以3％以上的速度逐年递增(AntoniouA,PharoahPD,NarodS,etal.AveragerisksofbreastandovariancancerassociatedwithBRCA1orBRCA2mutationsdetectedincaseseriesunselectedforfamilyhistory:Acombinedanalysisof22studies.AmericanJournalofHumanGenetics2003；72(5):1117–1130)。目前认为大多数遗传性乳腺癌是由于基因突变引起的，其中BRCA1和BRCA2基因的突变与乳腺癌发病关系较为密切。有研究表明，携带BRCA1或BRCA2基因致病性突变的女性在其70岁后患病风险增加了5-30倍，分别高达75％和46％(CaoW,WangX,LiJC.HereditarybreastcancerintheHanChinesepopulation.JEpidemiol.2013；23:75–84)。BRCA1基因定位于人类染色体17q12-21，全长81K，含24个外显子，编码蛋白含有1863个氨基酸残基。BRCA2基因定位于13q12.3，由27个外显子组成，编码蛋白含有3418个氨基酸残基。BRCA1和BRCA2基因都是肿瘤抑制基因，参与细胞周期的调控、基因转录的调节、DNA损伤的修复及凋亡等重要的细胞活动。一旦BRCA1或BRCA2基因发生致病性突变，致使其无法正常编码合成蛋白产物或合成的蛋白产物功能缺失，其抑癌作用将会受到影响，增加癌症发生发展的危险。2014版NCCN乳腺癌临床指南建议：BRCA1/2基因突变的遗传性乳腺癌高风险人群应采取必要的预防和监控措施，对于BRCA1/2基因突变阳性的患者需考虑对侧癌变的高风险(NCCNClinicalPracticeGuidelinesversion12014forbreastcancer)。若对于乳腺癌/卵巢癌患者，携带BRCA1/2基因致病性突变会使多发病灶和对侧癌变的风险增加。2014年12月，美国FDA批准抗癌新药Olaparib(Lynparza)用于治疗BRCA1或BRCA2基因突变的卵巢癌患者。近期临床研究表明，生殖系BRCA1或BRCA2突变的多种肿瘤可以从Olaparib治疗中得到缓解(KaufmanB,Shapira-FrommerR,SchmutzlerRK,etal:OlaparibmonotherapyinpatientswithadvancedcancerandagermlineBRCA1/2mutation.JClinOncol33:244-50,2015)。通过对BRCA1和BRCA2基因突变的检测，可以预测乳腺癌或卵巢癌发生发展，也可以筛选出乳腺癌、卵巢癌及其他相关恶性肿瘤的高危人群，针对卵巢癌患者，更可以从抗癌新药Olaparib中获益。目前，检测BRCA1/2基因突变的方法有很多，主要有：荧光定量PCR技术，该技术灵敏度高、特异性强，但每次只能检测一种类型的突变，无法完全覆盖BRCA1和BRCA2基因全编码区；限制小片段长度多态性分析法(RFLP法)，用于检测酶切位点改变的基因，可直接判断基因型，但是不能用于没有产生新酶切位点的基因检测，且实验操作繁琐，检测周期长，成本高；Sanger测序法，靠近引物的序列容易测不准，且测序周期较长，操作复杂，成本昂贵，很难满足实际应用的需要。因此，急需能够相对方便、快捷、检测周期短、针对性强、检测结果准确可靠的检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种快速、全面准确、操作简便、成本低的检测BRCA1和BRCA2基因全外显子及其与内含子连接区和非翻译区和启动子区突变的引物。为实现上述目的，本专利技术提供一种检测BRCA1和BRCA2基因全外显子及其与内含子连接区和非翻译区和启动子区突变的引物对，其特征在于，所述引物对中的上游引物为上游特异性引物，同时其5’端加上通用引物Tag1；下游引物为下游特异性引物，同时其5’端加上通用引物Tag2；其中上游特异性引物如SEQIDNO:1,3,5,7,9-193所示；下游特异性引物如SEQIDNO:2,4,6,8,10-194所示；所述Tag1序列如SEQIDNO:195所示，所述Tag2序列如SEQIDNO:196所示。进一步，还包括新的引物对，所述新的引物对中的上游引物为带有P5序列和SEQIDNO:221-236所示序列的上游引物；下游引物为带有P7序列和SEQIDNO:197-220所示序列的下游引物。本专利技术的另一个方面，提供检测BRCA1和BRCA2基因全外显子及其与内含子连接区和非翻译区和启动子区突变的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物对。本专利技术的另一个方面，提供检测BRCA1和BRCA2全外显子及其与内含子连接区和非翻译区和启动子区突变的方法，其特征在于，步骤为，文库制备：第一步PCR扩增：以待检测样本DNA作为模板，分为8管分别进行扩增；引物为上述所示序列；第二步PCR扩增：以第一步PCR扩增得到的产物为模板，引物为上述所示新的引物对序列；得到的第二步PCR扩增产物处理后即为文库；测序与结果分析：对文库进行测序，测序的结果经过数据处理后得到检测基因的突变情况；数据处理为测序数据的转换、质控、与参考基因组NCBI137/Hg19的序列比对、突变位点分析，通过数据处理后得到检测样本的突变信息。进一步，所述第一步PCR扩增的8管引物分别为：第一管的引物是SEQIDNO:1-30所示序列，第二管的引物是SEQIDNO:31-60所示序列，第三管的引物是SEQIDNO:61-80所示序列，第四管的引物是SEQIDNO:81-110所示序列，第五管的引物是SEQIDNO:111-140所示序列，第六管的引物是SEQIDNO:141-160所示序列，第七管的引物是SEQIDNO:161-180所示序列，第八管的引物是SEQIDNO:181-194所示序列。进一步，所述第一步PCR扩增的程序是94℃预变性2分钟，94℃变性45秒、60℃退火45秒、68℃延伸2分钟循环20次，72℃最后延伸10分钟。进一步，所述第二本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测BRCA1和BRCA2基因全外显子及其与内含子连接区和非翻译区和启动子区突变的引物对，其特征在于，所述引物对中的上游引物为上游特异性引物，同时其5’端加上通用引物Tag1；下游引物为下游特异性引物，同时其5’端加上通用引物Tag2；其中上游特异性引物如SEQ ID NO:1,3,5,7,9‑193所示；下游特异性引物如SEQ ID NO:2,4,6,8,10‑194所示；所述Tag1序列如SEQ ID NO:195所示，所述Tag2序列如SEQ ID NO:196所示。
【技术特征摘要】
1.一种检测BRCA1和BRCA2基因全外显子及其与内含子连接区和非翻译区和启动子区
突变的引物对，其特征在于，所述引物对中的上游引物为上游特异性引物，同时其5’端加上
通用引物Tag1；下游引物为下游特异性引物，同时其5’端加上通用引物Tag2；其中上游特异
性引物如SEQIDNO:1,3,5,7,9-193所示；下游特异性引物如SEQIDNO:2,4,6,8,10-194
所示；所述Tag1序列如SEQIDNO:195所示，所述Tag2序列如SEQIDNO:196所示。
2.权利要求1所述检测BRCA1和BRCA2基因全外显子及其与内含子连接区和非翻译区和
启动子区突变的引物对，其特征在于，还包括新的引物对，所述新的引物对中的上游引物为
带有P5序列和SEQIDNO:221-236所示序列的上游引物；下游引物为带有P7序列和SEQID
NO:197-220所示序列的下游引物。
3.一种检测BRCA1和BRCA2基因全外显子及其与内含子连接区和非翻译区和启动子区
突变的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物对。
4.一种检测BRCA1和BRCA2基因全外显子及其与内含子连接区和非翻译区和启动子区
突变的方法，其特征在于，步骤为，
文库制备：
第一步PCR扩增：以待检测样本DNA作为模板，分为8管分别进行扩增；引物为权利要求1
所示引物对序列；
第二步PCR扩增：以第一步PCR扩增得到的产物为模板，引物为权利要求2所示新的引物
对序列；
得到的第二步PCR扩增产物处理后即为文库；
测序与结果分析：对文库进行测序，测序的结果经过数据处理后得到检测基因的突变
情况；数据处理为测序数据的转换、质控、与参考基因组NCBI137/Hg19的序列比对、突变位
点分析，通过数据处理后得到检测样本的突变信息。
【专利技术属性】
技术研发人员：涂泽华，林清华，翁颖，康雅君，葛会娟，李旭超，阮力，郑立谋，
申请(专利权)人：厦门艾德生物医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35
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