一种马铃薯干腐病的分子检测方法技术

一种马铃薯干腐病的分子检测方法，属于分子生物学方法对病原菌进行分子检测的领域，是根据镰刀菌的rDNA区域保守序列设计特异性引物，建立了马铃薯干腐病致病菌的常规PCR检测体系。获得的马铃薯干腐病主要致病菌常规PCR检测特异引物序列为：上游引物：5′-GTAAAAGTCGTAACAAGGTC-3′；下游引物：5′-AAGTTCAGCGGGTATTC-3′；扩增靶带分别为560bp，扩增特异性专一，检测灵敏度可以达到1pg/μL，用于窖藏马铃薯干腐病的检测，检出率为100％。

【技术实现步骤摘要】
所属
本专利技术专利涉及一种检测马铃薯干腐病致病菌的分子检测方法，属于分子生物学方法对病原菌进行分子检测的领域。
技术介绍
植物病原真菌的分类鉴定主要依据其营养体和子实体的形态特征(方中达，1998)，由于形态特征容易受到培养条件和其它因素的影响，而且许多子实体类型经常难以获得，故给鉴定工作带来困难。然而真菌DNA的碱基组成具有遗传稳定，不易受环境影响，在生活史任何阶段均可获得等优点。ITS区域在不同菌株间存在丰富的变异，对ITS区进行序列分析不仅丰富了真核生物核糖体基因ITS的序列信息，为病原菌的分类鉴定及系统发育等研究提供了十分重要的资料和依据，同时也为建立病原菌的分子检测提供了一个准确和简便的方式，因而越来越受到植物病理学家们的重视。利用病原菌在rDNA-ITS区段既具保守性又在科、属、种水平上具有特异性序列的特性，对ITS区域进行PCR扩增、测序及序列分析后再设计特异性引物来检测和诊断植物病原菌，尤其是在植物病原真菌的分子检测中已越来越被广泛应用(王继华，2004；俞大绂，1997)。在我国对马铃薯干腐病的病原体的鉴定和检测技术，相对而言还相对落后。大多数病原体的鉴定和检测还是停留在传统生物学的水平上，甚至有些病原菌的监测技术在免疫学和电镜技术上还没有涉足，虽然这些传统生物学检测技术准确、直观、易于操作。但是，在检测特定病原菌时，需要的特定鉴别寄主不易获得，且耗时费力，已经不能适应生产上快速检测的需求，这对于马铃薯干腐病防治是一个致命的弱点。随着现代分子生物学技术的发展，除了传统的检测方法以外，分子生物学的检测方法也得到了发展，由于PCR技术已经广泛被应用，大大地提高了植物病害的病原菌的检出率，这对于马铃薯干腐病的病原菌的快速检测提供了一个有效的方法。本文对马铃薯干腐病的主要致病菌的rDNA-ITS序列进行分析设计了特异引物，利用常规PCR方法，建立马铃薯干腐病主要致病菌的分子检测体系。马铃薯是世界性的高产作物，其经济价值在世界作物中占第四位，中国是世界上马铃薯种植面积最大的国家。对于我国北方大部分地区，特别是黑龙江省，由于气候和土壤更适合马铃薯的生长，马铃薯产业快速的发展起来，已经成为黑龙江省农业经济发展的重要特色产业之一，年产量占全国的10％左右。随着马铃薯产业的不断发展，鲜薯的贮藏数量迅猛增加，贮藏周期进一步延长，对窖藏质量要求越来越高。镰刀菌干腐病是影响马铃薯贮藏质量的重要真菌病害，被镰刀菌侵染的薯块会出现腐烂变质。在窖藏过程中，由于窖温较高、湿度较大，镰刀菌病会大面积发生，往往会导致“烂窖”，一般年份损失率约15％-35％，重灾年高达50％左右，已经给我国马铃薯产业造成了巨大的经济损失。此外，镰刀菌在侵染马铃薯的时候，还会产生大量单端孢霉烯毒素，如果大量食用携带有毒素的薯块会造成人畜中毒。因此，马铃薯的镰刀菌病已经成为影响我国马铃薯储藏和商品品质的重大障碍。因此，开展黑龙江省马铃薯镰刀菌干腐病病原菌分离鉴定和分子检测技术的研究，建立灵敏度高、重复性好、定量准确、实用的镰刀菌检测体系对于早期预报和预防马铃薯干腐病的发生，对于马铃薯种薯的储藏及商品种薯品种的保证具有重要的现实意义。本专利技术专利依据镰刀菌的rDNA区域保守序列设计特异性引物，建立了马铃薯干腐病主要病原菌的常规PCR检测体系，从而确立一套马铃薯干腐病的快速、灵敏、准确的分子检测体系，并在田间进行应用，本专利建立的检测方法灵敏度高、重复性好、定量准确、实用的镰刀菌分子鉴定方法对于早期预报和预防马铃薯干腐病的发生，对于马铃薯种薯的储藏及商品种薯品种的保证是必要的。
技术实现思路
本专利技术根据镰刀菌高度保守的rDNA序列设计分子检测的特异引物，建立马铃薯干腐病致病菌的分子检测体系，确定了该检测体系的扩增特异性、灵敏度，并在田间进行应用；专用引物的序列为：上游引物：5′-GTAAAAGTCGTAACAAGGTC-3′；下游引物：5′-AAGTTCAGCGGGTATTC-3′；扩增目的片段为560bp，扩增特异性专一，检测灵敏度可以达到1pg/μL，用于窖藏马铃薯干腐病的检测，检出率为100％。1.技术方案1.1试验材料与方法1.1.1菌株和质粒马铃薯干腐病主要病原菌主要为6个菌株，分别为黄色镰刀菌(F.culmorum)、燕麦镰刀菌(F.avenaceum)、拟丝孢镰刀菌(F.trichothecioides)、拟枝镰刀菌(F.sporotrioides)、接骨木镰刀菌(F.sambucinum)、腐皮镰刀菌蓝色变种(F.solanivar.coeruleum(Sacc.))，各菌株保存在PDA斜面上，于25℃恒温暗室中培养10d后，置于4℃冰箱保存备用。所用大肠杆菌(Escherichacoli)菌株为DH5α，由本试验室保存。1.1.2试验方法1.1.2.1镰刀菌rDNA区域保守序列片段的克隆与测序(1)镰刀菌的基因组DNA提取采用改良SDS法提取镰刀菌的基因组DNA，各取3μLDNA稀释10倍，以稀释所用的超纯水为对照，Lambda35型分光光度计测其在260nm，280nm波长处的光吸收值、R值。DNA浓度(μg/mL)＝OD260×50×稀释倍数；总DNA的量(μg)＝DNA浓度(μg/mL)×体积(mL)；R＝A260/A280表示DNA在波长为260nm和280nm处吸光值的比值。(2)镰刀菌rDNA的引物设计从GenBank中查找镰刀菌rDNA序列的保守区域，应用PrimerPremier5.0软件设计引物：LDJ1上游引物：5′-GTAAAAGTCGTAACAAGGTC-3′LDJ2下游引物：5′-AAGTTCAGCGGGTATTC-3′扩增片段大小为560bp左右。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。(3)PCR扩增1)PCR反应以镰刀菌的基因组DNA为模板，用特异性引物进行目的基因的PCR扩增。首先用r-Taq酶进行预试验，扩增出目的片段后，改用LATaq酶进行扩增。扩增完毕，取5μLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，扩增产物用于回收，-20℃保存。r-Taq酶PCR反应体系如下：LA-Taq酶PCR反应体系如下：PCR反应条件如下：2)PCR扩增产物的电泳检测与鉴定扩增完毕，取PCR产物5.0μL上样于1.0％的琼脂糖凝胶上，同时用DNADL2000Marker作参照，100V恒压电泳1h，EB染色，在计算机凝胶成相系统上观察，如果存在扩增片段大小与设计相符的条带，即可进本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于镰刀菌的rDNA的马铃薯干腐病的分子检测方法，其特征为根据镰刀菌高度保守的rDNA序列设计分子检测的特异引物，建立马铃薯干腐病致病菌的分子检测体系，确定了该检测体系的扩增特异性、灵敏度，并在田间进行应用；专用引物的序列为：上游引物：5’‑GTAAAAGTCGTAACAAGGTC‑3’；下游引物：5’‑AAGTTCAGCGGGTATTC‑3’；扩增目的片段为560bp，扩增特异性专一，检测灵敏度可以达到1pg/μL，用于窖藏马铃薯干腐病的检测，检出率为100％。

【技术特征摘要】
1.一种基于镰刀菌的rDNA的马铃薯干腐病的分子检测方法，其特征为根据镰刀菌高度保守
的rDNA序列设计分子检测的特异引物，建立马铃薯干腐病致病菌的分子检测体系，确定了该
检测体系的扩增特异性、灵敏度，并在田间进行应用；专用引物的序列为：上游引物：5...

【专利技术属性】
技术研发人员：李凤兰，徐永清，冯艳忠，胡宝忠，郭梅，闵凡祥，韩峰，高云飞，魏琪，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23