一种增强型绿色荧光蛋白制造技术

本发明专利技术提供了一种比EGFP更增强型的绿色荧光蛋白GFPspark，其特征在于由SEQ.ID.NO：13所示EGFP的氨基酸序列中包含了Q81K，V164A，I168V这3个位点的突变。本发明专利技术还提供了编码所述蛋白质的多核苷酸序列SEQ.ID.NO：6。本发明专利技术中增强型绿色荧光蛋白的荧光亮度比EGFP强1.25倍，蛋白成熟速度比EGFP快2.1倍，光成熟速度比EGFP强1.2倍。该增强型荧光蛋白可应用于多个领域的研究，例如作为监测活细胞内基因表达、蛋白定位、细胞分化发育的良好标记。用GFPSpark融合目的蛋白基因的表达可以获得更明显的亮度照片，更易于目的蛋白表达的定位和相互作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一些新的荧光蛋白，本专利技术的荧光蛋白是对来自大型多管水母的增强型绿色荧光蛋白多肽(EGFP)的改造，所得新型荧光蛋白与EGFP具有相同的激发和发射光谱，但其荧光强度更强、成熟更快，其特征在于由SEQ.ID.NO：1所示氨基酸序列中Q81K，V164A，I168V位置上至少具有一个氨基酸替换的氨基酸序列所组成。本专利技术还涉及上述荧光蛋白基因的克隆、表达及应用。
技术介绍
绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)是一类存在于包括水母、水媳和珊瑚等腔肠动物的生物发光蛋白，当受到特定光谱激发时，GFP发射绿色荧光。最初是由Chalfie分离自AequoreaVictoria(美国专利5,491,084)。Ward和Chalfie在PCT公布WO95/21191中报道对其氨基酸序列作了修饰以增加其亮度。在Chalfie等首先异源表达出野生型GFP基因之后不久，美国Tsien研究小组就通过随机突变从表达GFP的大肠杆菌中筛选出了几株荧光强度更强的和/或荧光光谱改变的GFP变体，随后该研究小组及其他研究小组又通过类似方法筛选出一些理化、生物学性质有所改变的变体，如荧光强度增强的GFP(EGFP)、光谱变异的GFP、易表达的GFP。EGFP为增强型GFP荧光蛋白，它是在大型水母GFP的蛋白序列上包含了4个氨基酸的突变(F64L，S65T，A72S和H231L)。该突变可以明显提高在最大激发峰下的摩尔消光系数，将亮度提高2.08倍(表1)。突变GFP的序列，使其蛋白结构更易于成熟，荧光基团也更易于成熟将明显提高荧光蛋白的亮度。表1：GFP和EGFP蛋白的亮度参数GFP的变体可作为细胞内基因表达的报告基因，研究基因表达的调控。GFP荧光蛋白的检测极其方便，一旦正确折叠形成晶体，利用蓝光激发就可以检测到它的表达，因此gfp及其变体作为报告基因具有不需要底物和辅助因子的优越性。可以构建各种缺失了启动子或增强子序列的gfp载体，利用它们来作为荧光作为测定组织特异性启动子和特殊的增强子。利用已知技术易于将编码目的蛋白的核苷酸序列与gfpDNA突变体在氨基末端或羧基末端相连，从而制备融合蛋白。GFP及其变体可作为其他蛋白的分子标记，与其他蛋白融合表达，监测活细胞内基因表达、蛋白定位、细胞分化发育的良好标记及疾病诊断等。为了进一步获得新的荧光强度增强的GFP变体，本专利技术人采用新型体外突变技术“DNA重排(DNAshuffling)技术”结合“基因突变技术”对现有的增强型EGFP上进行定点饱和突变和随机突变，然后通过DNA重排建库，筛选得到突变体GFPSpark。
技术实现思路
本专利技术的一个方面，提供了一种更稳定的增强型荧光蛋白，其特征在于SEQ.ID.NO：13所示氨基酸序列，与EGFP相比，包含了Q81K，V164A，I168V位置上由相应氨基酸替换的序列所组成。与亲本蛋白相比，所述荧光蛋白在37℃条件下表达蛋白成熟更快，产生的荧光强度更高，在哺乳动物细胞中能获得良好表达。本专利技术的又一方面，还提供了上述项荧光蛋白与目的基因融合在一起表达，用于检测细胞内基因表达、蛋白定位的标记等用途。该更稳定的增强型荧光蛋白比EGFP能激发出更强的亮度，指导蛋白的表达和细胞定位。附图说明图1：HPLC检测EGFP和GFPSpark的纯度，如图所示EGFP(图A)和GFPSpark(图B)的SEC-HPLC结果为94.58％和96.51％，HPLC显示两种蛋白的纯度较好，结构相同，均为单体结构。图2：SDS-PAGE检测EGFP和GFPSpark的纯度及大小，如图所示EGFP和GFPSpark两种蛋白的纯度较好，大小与预测一致。图3：GFPSpark蛋白的荧光光谱测定，其中横轴为波长，纵轴为荧光强度，由图可看到，本专利技术GFPSpark蛋白的激发峰为487nm，发射峰为508nm。图4：EGFP和GFPSpark的pH稳定性测定，图片显示EGFP的pka为5.0，GFPSpark的pka为4.5。图5：真核细胞内亚细胞器的pH值情况。图6：EGFP和GFPSpark的消光系数检测，图片是依据检测进行的曲线拟合计算，EGFP的消光系数为39000，GFPSpark的消光系数为47000。图7：EGFP和GFPSpark的量子产率检测，图片显示检测时扫描的波谱图。以EGFP的量子产率0.60为参照，计算得到GFPSpark的量子产率为：0.62。图8：变性后的EGFP和GFPSpark的再折叠检测，EGFP和GFPSpark的荧光基团成熟检测。图A显示EGFP和GFPSpark的再折叠速率分别为：570s和270s；图B显示EGFP和GFPSpark的荧光基团成熟速率分别为：1560s和1305s。图9：荧光蛋白的光漂白特性检测，图片显示了荧光蛋白在紫外光作用下荧光稳定性的变化趋势。图10：GFPSpark与目的基因融合表达载体示意图，图A为GFPSpark放在目的基因N端表达的载体示意图，图B为GFPSpark放在目的基因C端表达的载体示意图。图11：在Hela细胞系中，线粒体蛋白AK4与GFPSpark融合蛋白(图A)和AK4与EGFP融合蛋白(图B)表达荧光图像。图12：在Hela细胞系中，细胞骨架蛋白TUBB与GFPSpark融合蛋白表达的荧光图像。图13：在Hela细胞系中，高尔基体蛋白GOLM1与GFPSpark融合蛋白表达的荧光图像。具体实施方式实施例1.GFP突变文库的构建：通过Discoverystudio4.0蛋白结构分析软件对EGFP(氨基酸序列见SEQ.ID.NO：1)结构的分析，找出可能影响GFP结构的32个位点，这32个位点是：D20，K27，S31，T39，Y40，F47，I48，V69，S73，Q81，A88，F100，N106，K108，D118，L126，E143，M154，V164，I168，I172，D174，S176，L179，G190，L195，Q205，A207，K215，M219，V225，L232。按照间隔的点突变，将这32个点错开分成8组。分别对每组每个位点的氨基酸序列做饱和突变，这样得到了8组饱和突变的基因库编号为mut1-8；同时用易错PCR方法(errorpronePCR)对EGFP基因进行随机突变，得到一组突变基因库，mut-9；将这9组突变基因的PCR混合物采用DNAShuff本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种增强型绿色荧光蛋白GFPSpark，其特征在于：a)氨基酸序列为SEQ.ID.NO：13；b)大型水母绿色荧光蛋白的荧光增强型突变体；c)包含三个位点的氨基酸突变的组合：Q81K，V164A，I168V；d)具有更强的荧光亮度；e)具有更快的荧光蛋白和荧光基团的成熟速度。

【技术特征摘要】
1.一种增强型绿色荧光蛋白GFPSpark，其特征在于：
a)氨基酸序列为SEQ.ID.NO：13；
b)大型水母绿色荧光蛋白的荧光增强型突变体；
c)包含三个位点的氨基酸突变的组合：Q81K，V164A，I168V；
d)具有更强的荧光亮度；
e)具有更快的荧光蛋白和荧光基团的成熟速度。
2.一种定位蛋白细胞器和/或细胞外表达的方法，该方法包括：
a)采用基因工程技术将目的蛋白基因和权利要求1所述的更稳定的增强型
绿色荧光蛋白基因序列(SEQ.ID.NO：6)融合成为融合蛋白；
b)将融合蛋白的基因序列插入到适合的表达载体中；
c)将融合蛋白表达载体转染细胞，并在上...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙春昀，谢良志，任为，高一夫，尹怀奇，
申请(专利权)人：北京义翘神州生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11