一种分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，该杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株5H1E9E8D7H12，已于2015年8月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO.C2015118；地址为中国武汉武汉大学。本发明专利技术以环丙沙星与牛血清白蛋白形成的偶联物为抗原，免疫BALB/c小鼠，再将免疫后的小鼠的脾脏细胞与复壮的SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，并采用不添加抗菌素的培养基进行细胞培养，经多次筛选和克隆获得杂交瘤细胞株；该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体灵敏度高，特异性强，可用于喹诺酮类药物的快速、准确免疫检测和免疫分析。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。
技术介绍
喹诺酮类(QuinoIones，QNs)是一类化学合成的抗菌药，由于这类药物高效低毒、价格低廉，所以多年来被广泛应用于畜禽、水产养殖领域，用于预防和治疗疾病。过量或不当使用喹诺酮类药物会造成其在动物农产品中残留和蓄积。喹诺酮类药物品种繁多，其在动物体内还会转化生成多种其它喹诺酮类药物，而且即使用的是兽用药，在体内也会转化成临床药物品种。人体摄入被QNs污染的农产品后，除了可能会引起关节病变、消化道反应、肝肾毒性、血液系统毒性等不良反应，长期食用含低剂量的抗菌素，机体还会产生耐药性，甚至产生超级细菌，从而不利于该类药物对人类疾病的治疗。目前，对于喹诺酮类药物残留的检测方法主要有高效液相色谱法、液相-串联质谱法，这些方法具有定量精度高的特点，但仪器成本高、操作复杂、检测时间长、不能用于现场检测，因而不适用于基层单位的应用，无法满足农产品市场准入制度实施对检测方法时效性的需求。利用抗体与抗原的反应为核心发展起来的免疫学检测方法主要有：酶联吸附免疫法(ELISA)和免疫胶体金法(GICT)分别具有高通量检测和操作简便、快速等优点，因而尤其适合在基层单位的应用和现场快速检测。开发药物残留检测免疫试剂盒所面临的主要难题除了检测结果假阳性、假阴性率偏高，还有其核心原料(抗体)批量小、批间差异大且价格昂贵。出现假阳性和假阴性分别是由于方法的特异性和灵敏度不够，而免疫学检测方法的特异性和灵敏度又主要由抗体所决定。常用的单克隆抗体生产方法是将杂交瘤细胞输入动物体内，当动物腹部膨大产生腹水时，再抽取腹水获得抗体，但此方法不足之处为小鼠腹水量少而且动物个体差异使每只动物所产抗体的质量和产量均有较大差异，从而造成抗体批量小且批间差异大；而有些国家和地区禁止在动物体内制备抗体。申请公布号为CN102618502A的专利技术专利申请文献公开了一种分泌抗喹诺酮类药物单抗的杂交瘤细胞株及其单抗应用，该细胞株的保藏编号为CGMCCNO5608，能够分泌亚型为IgG1κ链的单克隆抗体，经间接竞争ELISA分析表明该单抗与环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、达氟沙星等喹诺酮类药物有特异反应，IC50为3.65ng/mL；可用于检测食品中喹诺酮类药物的残留。申请公布号为CN101792738A的专利技术专利申请文献公开了一种环丙沙星单克隆抗体细胞株及其单克隆抗体，该细胞株由骨髓瘤细胞与产生抗环丙沙星抗体的脾细胞融合制备而成，保藏编号为CCTCCNO.C200947，能够与环丙沙星、恩诺沙星攒在90％的交叉反应，而氧氟沙星、双氟沙星、沙拉沙星、氯霉素、孔雀石绿均无交叉反应，IC50为3.45ng/mL，实现在水产品中快速检测残留的环丙沙星。
技术实现思路
本专利技术提供了一种分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，该杂交瘤细胞株能够在体外培养条件下大量分泌高灵敏度、高特异性的抗喹诺酮类药物的单克隆抗体。一种分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株5H1E9E8D7H12，已于2015年8月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(ChinaCenterforTypeCultureCollection，简称CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO.C2015118；中国典型培养物保藏中心的地址为：中国.武汉.武汉大学。本专利技术提供了所述杂交瘤细胞株在制备喹诺酮类药物检测试剂盒中的应用。本专利技术提供了所述杂交瘤细胞株在制备用于检测喹诺酮类药物的试纸条中的应用。本专利技术提供了一种所述杂交瘤细胞株的制备方法，包括：(1)将牛血清白蛋白和环丙沙星混合制备偶联物，再用所述偶联物免疫动物，获得能够产生抗喹诺酮类药物抗体的脾细胞；(2)将所述脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经筛选、克隆后，获得所述杂交瘤细胞株；其特征在于，所述牛血清白蛋白与环丙沙星的投料比为1:10～30；所述偶联物的偶联比为2～6:1。作为优选，所述的筛选和克隆在无抗菌素的条件下进行。具体地，所述的动物为BALB/c小鼠。本专利技术还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体由所述的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。具体地，所述单克隆抗体的亚型为IgG1λ链，与喹诺酮类药物有特异性反应。作为优选，所述单克隆抗体通过体外培养的方式获得。本专利技术还提供了所述的单克隆抗体在检测喹诺酮类药物中的应用。本专利技术还提供了所述的单克隆抗体在检测动物源食用农产品残留喹诺酮类药物中的应用。作为优选，所述的喹诺酮类药物为环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、丹诺沙星、沙拉沙星、麻保沙星、培氟沙星、洛美沙星、双氟沙星、依诺沙星、氟甲喹、加替沙星、噁喹酸、氟罗沙星和司帕沙星中的至少一种。本专利技术还提供了一种喹诺酮类药物的检测试剂盒，含有所述的单克隆抗体。具体地，所述的试剂盒中含有所述杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生的单克隆抗体、酶标板、喹诺酮类药物标准品，酶标记物(酶标二抗)、底物和终止液，其中，酶标板上包被有人工合成的抗原(竞争物)。使用时，待待检样品与抗体加入酶标板完成反应后，再加入酶标记物，若样品中含有喹诺酮类药物，则会与酶标板上的抗原竞争结合抗体，再加入底物反应，终止显色。显色强度与样品中残留的喹诺酮类药物量成反比。根据喹诺酮类药物标准品做出的标准曲线，计算出样品中的喹诺酮类药物的含量。本专利技术还提供了一种用于检测喹诺酮类药物的试纸条，包括：样品垫、标记物垫、反应膜和吸样垫，所述标记物垫包被有胶体金标记、荧光标记或量子点标记的由所述杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生的单克隆抗体。本专利技术的试纸条中，所述反应膜的检测线(T线)处包被有环丙沙星-卵清蛋白偶联物(CIP-OVA)，所述反应膜的质控线(C线)处包被有二抗。所述二抗选用羊抗鼠IgG。与现有技术相比，本专利技术具有的有益效果为：本专利技术以环丙沙星与牛血清白蛋白形成的偶联物为抗原，免疫BALB/c小鼠，再将免疫后的小鼠的脾脏细胞与复壮的SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，并采用不添加抗菌素的培养基进行细胞培养，经多次筛选和克隆获得杂交瘤细胞株；该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体灵敏度高，特异性强，可用于喹诺酮类药物的快速、准确免疫检测和免疫分析。附图说明图1为免疫抗原环丙沙星-牛血清白蛋白偶联物(CIP-BSA)的质谱图；图2为单抗对环丙沙星(CIP)间接竞争ELISA的标准曲线；图3为杂交瘤细胞株5H1E9E8本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，命名为杂交瘤细胞株5H1E9E8D7H12，保藏编号为CCTCC NO.C2015118。

【技术特征摘要】
1.一种分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，命名为杂交瘤
细胞株5H1E9E8D7H12，保藏编号为CCTCCNO.C2015118。
2.如权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备检测喹诺酮类药物的试剂盒和试纸条中的
应用。
3.一种制备如权利要求1所述杂交瘤细胞株的方法，包括：
(1)将牛血清白蛋白和环丙沙星混合制备偶联物，再用所述偶联物免疫动物，获得能够
产生抗喹诺酮类药物抗体的脾细胞；
(2)将所述脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经筛选、克隆后，获得所述杂交瘤细胞株；
其特征在于，所述牛血清白蛋白与环丙沙星的投料比为1:10～30；所述偶联物的偶联
比为2～6:1。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳爱春，
申请(专利权)人：杭州市农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：浙江;33