一种重组腺相关病毒及其构建方法和应用技术

本发明专利技术的重组腺相关病毒，所述重组腺相关病毒是通过将肿瘤抗原基因插入到穿梭表达载体pAAV-MCS中，形成的重组腺相关病毒。本发明专利技术还提供了该重组腺相关病毒的构建方法以及其应用。本发明专利技术的重组腺相关病毒，利用携带有肿瘤相关抗原基因的重组腺相关病毒感染DC细胞，在DC细胞中表达肿瘤相关抗原蛋白，该重组腺相关病毒的应用方法中还联合PD-1基因沉默CTL细胞。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种重组腺相关病毒及其构建方法和应用。
技术介绍
免疫细胞肿瘤治疗技术是一种以现代生物技术手段激发自身免疫系统来对抗肿瘤的新型的、具有显著疗效的治疗方法，是继手术、放疗和化疗等传统治疗法之后的第四大肿瘤治疗技术。目前大量研究已经表明，对于中晚期恶性肿瘤患者而言，过继性细胞免疫治疗具有其他治疗方式无法比拟的优越性，是治疗中晚期恶性肿瘤的有效手段之一，具有十分广阔的临床应用前景。虽然国内已经有很多医疗机构进行了肿瘤免疫治疗的相关研究和临床实践，但仍存在很多问题，主要表现在：(1)以缺乏特异性的CIK治疗为主，技术水平比较落后；(2)未全面掌握国际先进的核心技术，医院细胞制备质量管理不符合要求，没有统一的标准和流程；(3)缺乏大规模的临床数据支持，无法确认有效性标准等。这些问题制约了国内肿瘤免疫治疗技术的发展，也给患者的治疗带来隐患。腺相关病毒(简称AVV)属微小病毒家族的成员，为无包膜的单链线状DNA病毒。AAV的基因组约4700bp，包括上下游两个开放读码框架(ORF)，位于分别由145个核苷酸组成的2个反向末端重复序列(ITR)之间。腺相关病毒具有安全性高、免疫原性低、能介导基因在动物体内长期稳定表达等优点，因而被认为是最有潜力成为基因治疗工具的载体。但是目前并没有靶向性强的、适于肿瘤治疗的重组腺相关病毒。
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是现有技术中的肿瘤免疫治疗特异性较差、治疗效果不理想的问题，进而提供一种可实现靶向性强的免疫治疗的重组腺相关病毒的应用方法。本专利技术要解决的第二个技术问题是提供一种感染DC细胞后免疫原性更低、抗原致敏时间更长、DC抗原效率更高的携带有肿瘤抗原基因的重组腺相关病毒。本专利技术的重组腺相关病毒，所述重组腺相关病毒是通过将肿瘤抗原基因插入到穿梭表达载体pAAV-MCS中，形成的重组腺相关病毒。构建本专利技术所述的重组腺相关病毒的方法，包括以下步骤：(1)将肿瘤抗原基因插入到穿梭表达载体pAAV-MCS中，使所述肿瘤抗原基因进入包含ITR的载体，形成重组质粒；(2)大量抽提步骤1)中所述的重组质粒，与pHelper和pAAV-RC质粒采用磷酸钙沉淀法共同转染AAV-293细胞，培养2--3天，收集培养基和细胞，采用反复冻融法收集粗病毒液。或者，构建本专利技术所述的重组腺相关病毒的方法，包括以下步骤：(1)将肿瘤抗原基因插入到穿梭表达载体pAAV-MCS中，使所述肿瘤抗原基因进入包含ITR的载体，形成重组质粒；(2)从生产病毒的细胞中纯化AAV2病毒颗粒，细胞经AAVproExtractionSolution初步纯化后，利用核酸酶进行处理，然后让AAV2颗粒与预装柱结合，经过洗涤和洗脱，即可得到高纯度的AAV颗粒。需要说明的是，肿瘤相关抗原(TAA)不仅作为肿瘤标志物与肿瘤特异性的抗体结合用于免疫检测与诊断，而且也是抗肿瘤免疫攻击的靶点。肿瘤抗原基因的克隆与鉴定，为肿瘤疫苗的研究奠定了基础。肿瘤抗原目的基因一般基因是指编码某抗原的cDNA序列，要求该基因片段能在哺乳动物细胞中表达。利用抗原递呈细胞(APC，如树突状细胞)递呈抗原并激活T细胞的能力。从外周血分离、扩增树突状细胞，再导入肿瘤相关抗原基因，基因表达后递呈抗原信息以激活T细胞，产生抗肿瘤特异性免疫反应。目的基因一般是抗原基因的全长cDNA序列，用以表达该抗原的全蛋白。但有些抗原基因表达的全蛋白存在毒副作用，可能诱发自身免疫反应，或者是全蛋白抗原递呈效果不如抗原决定簇或某一段基因表达的蛋白有效。需要针对该基因通过基因工程方法进行改良或选择其中的一段基因进行表达。根据不同的目的基因的特性，针对性地确定需要表达的基因序列。本专利技术所述的重组腺相关病毒的应用方法，包括以下步骤(1)：使所述重组腺相关病毒感染DC细胞，并在DC细胞中表达肿瘤相关抗原蛋白。优选地，所述的重组腺相关病毒的应用方法还包括以下步骤(2)：采用siRNA干扰方式沉默PD-1基因，阻断PD-1/PD-L1信号。所述PD-1/PD-L1的含义为PD-1或者PD-L1，其英文名称为ProgrammedDeath1。优选地，所述步骤(2)具体为：a)将具有SEQIDNo.1所示的序列结构的siRNA-1、具有SEQIDNo.2所示的序列结构的siRNA-2、具有SEQIDNo.3所示的序列结构的siRNA-3，上述三对针对PD-1mRNA的siRNA作用靶点，合成发夹样的两端配对siRNA的模板DNA，中间以6个脱氧核苷酸的LOOP相连，分别在3’端加入终止信号polyT，两端分别加入限制性内切酶AgeI和EcoRI的酶切位点粘性末端，同时合成互补DNA链；b)将具有SEQIDNo.4所示的序列结构的siRNA-1-1、具有SEQIDNo.5所示的序列结构的siRNA-1-2、具有SEQIDNo.6所示的序列结构的siRNA-2-1、具有SEQIDNo.7所示的序列结构的siRNA-2-2、具有SEQIDNo.8所示的序列结构的siRNA-3-1、具有SEQIDNo.9所示的序列结构的siRNA-3-2插入载体；c)合成ShRNA的模板DNA双链，构建shRNA重组质粒。其中，所述SEQIDNo.1所示的序列结构如下：CGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTA；所述SEQIDNo.2所示的序列结构如下：TGAGCAGACGGAGTATGCCACCATT；所述SEQIDNo.3所示的序列结构如下：CAGACGGAGTATGCCACCATTGTCT；所述SEQIDNo.4所示的序列结构，即siRNA-1-1，如下：CcggCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACTCGAGTACCAGTTTAGCACGAAGCTCTCCGTTTTTg；所述SEQIDNo.5所示的序列结构，即siRNA-1-2，如下：aattcaaaaaCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACTCGAGTACCAGTTTAGCACGAAGCTCTCCG；所述SEQIDNo.6所示的序列结构，即siRNA-2-1，如下：CcggTGAGCAGACGGAGTATGCCACCATTCTCGAGAATGGTGGCATACTCCGTCTGCTCATTTTTg；所述SEQIDNo.7所示的序列结构，即siRNA-2-2，如下：aattcaaaaaTGAGCAGACGGAGTATGCCACCATTCTCGAGAATGGTGGCATACTCCGTCTGCTCA；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组腺相关病毒，其特征在于，所述重组腺相关病毒是通过将肿瘤抗原基因插入到穿梭表达载体pAAV‑MCS中，形成的重组腺相关病毒。

【技术特征摘要】
1.一种重组腺相关病毒，其特征在于，所述重组腺相关病毒是通过将肿瘤抗原基因插
入到穿梭表达载体pAAV-MCS中，形成的重组腺相关病毒。
2.一种构建权利要求1所述的重组腺相关病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将肿瘤抗原基因插入到穿梭表达载体pAAV-MCS中，使所述肿瘤抗原基因进入包含
ITR的载体，形成重组质粒；
(2)大量抽提步骤1)中所述的重组质粒，与pHelper和pAAV-RC质粒采用磷酸钙沉淀法
共同转染AAV-293细胞，培养2--3天，收集培养基和细胞，采用反复冻融法收集粗病毒液。
3.一种构建权利要求1所述的重组腺相关病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将肿瘤抗原基因插入到穿梭表达载体pAAV-MCS中，使所述肿瘤抗原基因进入包含
ITR的载体，形成重组质粒；
(2)从生产病毒的细胞中纯化AAV2病毒颗粒，细胞经AAVproExtractionSolution初
步纯化后，利用核酸酶进行处理，然后让AAV2颗粒与预装柱结合，经过洗涤和洗脱，即可得
到高纯度的AAV颗粒。
4.一种权利要求1中所述的重组腺相关病毒的应用方法，其特征在于，包括以下步骤
(1)：使所述重组腺相关病毒感染DC细胞，并在DC细胞中表达肿瘤相关抗原蛋白。
5.根据权利要求4所述的重组腺相关病毒的应用方法，其特征在于，还包括以下步骤
(2)：采用siRNA干扰方式沉默PD-1基因，阻断PD-1/PD-L1信号。
6.根据权利要求5所述的重组腺相关病毒的应用方法，其特征在于，所述步骤(2)具体
为：
a)将具有SEQIDNo.1所示的序列结构的siRNA-1、具有SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙振华，曹晖，
申请(专利权)人：厚朴生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32