本发明专利技术涉及乙型肝炎肝硬化患者的个体易感性。具体地，本发明专利技术涉及与乙型肝炎肝硬化相关的易感基因IL-6的rs10499563位点标志物在乙型肝炎肝硬化患者评估中的应用。本发明专利技术提供了一种与乙型肝炎肝硬化相关的IL-6基因rs10499563位点标志物及其检测试剂和检测方法。本发明专利技术还提供了与乙型肝炎肝硬化患者评估相关的IL-6基因的SNP位点，即IL-6基因rs10499563位点T等位基因及其在乙型肝炎肝硬化患者评估中的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及乙型肝炎肝硬化患者的个体易感性。具体地，本专利技术涉及与乙型肝炎肝硬化相关的易感基因IL-6的rs10499563位点标志物在乙型肝炎肝硬化患者评估中的应用。
技术介绍
2015年WHO更新的数据显示，全球慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者约2亿4000万人。全世界更有每年超过78万的人死于乙型肝炎的各种并发症，包括肝硬化和肝癌。我国是病毒性肝炎高发区，现有的慢性HBV感染者约9300万人，其中慢性乙型肝炎(CHB)患者约2000万人。一般慢性乙型肝炎是渐进发展引起并发症，但是部分病人并没有经历明显的慢性乙型肝炎的过程就突然出现肝硬化的症状和体征，有些患者甚至到了失代偿阶段才被发现。于是，对慢性乙型肝炎肝硬化科学地预警预测和早期诊断早期干预对于控制病情发展和降低病死率至关重要。IL-6是由184个氨基酸组成的经典的细胞因子，它的基因位于7号染色体上。IL-6有2个受体：IL-6受体(IL-6R)和gp130。IL-6R有2种形式，膜型IL-6R和可溶性IL-6R(sIL-6R)。IL-6通过膜型IL-6R介导的是经典的信号通路，通过sIL-6R介导的是反式信号通路。对于健康人来说，血浆水平的IL-6几乎测不到。但是，在慢性炎症性疾病中，比如慢性乙型肝炎，可以检测到异常分泌的血浆IL-6水平。有研究显示，IL-6水平在慢性乙型肝炎(CHB)病人中比在健康人中显著升高，并且相比CHB病人，IL-6水平在晚期肝病(肝硬化或者肝癌)病人中表达的更显著。而该基因的多态性可能改变其表达或者结合活性，从而影响肝损伤和疾病严重程度。因此，IL-6基因多态性分析对于CHB患者病情转归的判断和预警具有重要价值，特别是对于慢性乙型肝炎进展为肝硬化的预警更有不可替代的意义。
技术实现思路
为了解决以上问题，本专利技术提供了一种与乙型肝炎肝硬化相关的IL-6基因rs10499563位点标志物及其检测试剂和检测方法。与乙型肝炎肝硬化相关的IL-6基因rs10499563位点标志物，IL-6基因的rs10499563位点表现为T等位基因。一种试剂，用于检测IL-6基因rs10499563位点的试剂。一种试剂盒，包含用于检测IL-6基因rs10499563位点的试剂和PCR技术常用的试剂。一种检测IL-6基因rs10499563位点标志物的方法，采用Taqman探针法，包括如下步骤：1)于ABI公司购买用于IL-6基因rs10499563位点的检测引物和Taqman探针，并对样本基因组DNA在RocheLC480ⅡPCR仪上进行特异性PCR扩增，所述Taqman探针被两种荧光染料Vic、Fam双标记，该探针分别是针对双等位SNP的不同基因型，只有完全匹配的探针才能扩增出各自对应的基因型；2)按下列条件进行反应：起始95℃预热10min，然后95℃变性10s，60℃退火和延伸30s，循环45次；产物在RocheLC480Ⅱ型荧光定量PCR仪上扫描读取数据，分析得出研究对象的基因型。用于检测IL-6基因rs10499563位点的试剂在制备用于乙型肝炎肝硬化诊断试剂盒中的应用。专利技术人首先对IL-6基因SNP位点进行了筛选。先通过查询大量相关文献或记录，筛选出可能和疾病之间存在关联的SNP位点；然后在第二代HapMap数据库中，以MAF>5％为入选标准，筛选了rs10499563位点。因此本专利技术鉴定了评估乙型肝炎肝硬化患者的IL-6基因的SNP位点。本专利技术还提供了一种检测与乙型肝炎肝硬化患者评估相关的IL-6基因SNP位点rs10499563的Taqman探针法。如上所述，本专利技术采用了一种检测与乙型肝炎肝硬化患者评估相关的IL-6基因SNP位点rs10499563的方法，该方法为Taqman探针法，具体地说，包括了如下步骤：1.针对IL-6基因rs10499563位点，于ABI公司购买引物和探针，并对样本基因组DNA在RocheLC480ⅡPCR仪上进行特异性PCR扩增。Taqman探针被进行过双标记，其分别是针对双等位SNP的不同基因型，只有完全匹配的探针才能扩增出各自对应的基因型；而这两种探针分别被两种荧光染料Vic，Fam标记。2.按下列条件进行反应：起始95℃预热10min，然后95℃变性10s，60℃退火和延伸30s，循环45次。产物在RocheLC480Ⅱ型荧光定量PCR仪上扫描读取数据，分析得出研究对象的基因型。另一方面，本专利技术还提供了与乙型肝炎肝硬化患者评估相关的IL-6基因的SNP位点，即IL-6基因rs10499563位点T等位基因及其在乙型肝炎肝硬化患者评估中的应用。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术进行详细说明。实施例1该实施例采用了一种检测与乙型肝炎肝硬化患者评估相关的IL-6基因SNP位点的方法。一、基因组DNA的提取采用美国Qiagen公司QIAampDNABloodMini试剂盒，并按说明书方法提取全血DNA。实验前准备：提前一天将血液样品转移至4℃冰箱，让血液融化。打开金属浴并调到56℃，准备好离心管，口罩，餐巾纸，厨房用纸，酒精喷壶，废纸篓，废液缸等。(参照qiagen试剂盒)1.向1.5ml离心管中加入20ul蛋白酶；如需去除RNA，再向管内加入4ulRNA酶。2.在1.5ml离心管中加入200ul样品；吸取血液时请不要碰触管壁，以免污染移液器。3.加入200ul缓冲液AL，充分颠倒混匀，振荡15s。4.56℃温浴1h左右。5.加入200ul无水乙醇，充分混匀15s(不可剧烈振荡)，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。6.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，8000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱放入新的收集管中。7.向吸附柱中加入500ul缓冲液AW1，8000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱放入新的收集管中。8.向吸附柱中加入500ul缓冲液AW2，8000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱放入新的收集管中。9.将吸附柱放入新的收集管中，13000rpm离心3min，倒掉废液。将吸附柱置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附柱材料中残余的漂洗液。10.将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50ulBufferAE。室温孵化5min。8000转离心1min。11：重复步骤10。质检后放-80℃保存。二、PCR扩增按下列组分配置PCR反应体系，配制过程在冰上进行。按下列条件本文档来自技高网...
【技术保护点】
与乙型肝炎肝硬化相关的IL‑6基因rs10499563位点标志物，其特征在于：IL‑6基因的rs10499563位点表现为T等位基因。
【技术特征摘要】
1.与乙型肝炎肝硬化相关的IL-6基因rs10499563位点标志物，其特征在于：IL-6基因的
rs10499563位点表现为T等位基因。
2.一种试剂，其特征在于：用于检测权利要求1所述IL-6基因rs10499563位点的试剂。
3.一种试剂盒，其特征在于：包含权利要求2所述的试剂和PCR技术常用的试剂。
4.一种检测权利要求1所述IL-6基因rs10499563位点标志物的方法，其特征在于：采用
Taqman探针法，包括如下步骤：
1)于ABI公司购买用于IL-6基因rs10499563位点的检测引物和Taq...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑敏，陈智，夏彩霞，刘艳宁，陈峰，黄春红，楼国华，朱伟，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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