一种石斛超低温保存脱毒的方法技术

本发明专利技术涉及一种石斛超低温保存脱毒的方法，属于植物病毒防治技术领域。本发明专利技术为了更有效的保护即将濒危的石斛，提高种苗质量，生产无病毒种苗，本发明专利技术提供了一种新型的石斛超低温保存脱毒方法，能有效提高种苗脱毒率。与传统的脱毒方法相比超低温脱毒具有脱毒率高，脱毒率不受茎尖大小的影响，具有取材方便，操作简单，不需要特殊的仪器、设备和昂贵的药品试剂，且周期短，可同时用于种质资源的保存与脱毒的优点，易于推广应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物病毒防治
，具体涉及一种石斛超低温保存脱毒的方法。
技术介绍
石斛（DendrobiumnobileLindl），又名万丈须、吊兰、林兰等，是兰科中的大属，有1500-1600个原生种，主要分布于亚洲的热带、亚热带地区和大洋洲，我国有76种，主要分布于西南和华南地区。茎直立，肉质状肥厚，稍扁的圆柱形，长10-60厘米，粗达1.3厘米。石斛是著名的中药材，性味甘淡微咸，寒，归胃、肾，肺经。益胃生津，滋阴清热。用于阴伤津亏，口干烦渴，食少干呕，病后虚热，目暗不明。石斛花姿优雅，玲珑可爱，花色鲜艳，气味芳香，被喻为“四大观赏洋花”之一。由于石解属植物生长缓慢，种子极其微小，且胚具有生理后熟现象，自然繁殖条件下种子萌发率小于5%，加之长期非法采挖，致使多种石解原生种已濒临灭绝。自1987年开始，石解先后被列为《中华人民共和国珍稀濒危植物录》、《濒危野生动植物种国际贸易公约》中级保护植物，2001年石解属全部被列入《国家重点保护野生植物名录（第2批户）》。国内外利用石斛的茎节、花梗、幼叶尖为外植体快繁组培苗，在移栽技术方面已做了大量的研究工作，但市场上石斛商品药材仍然短缺。就其原因在于组培苗移栽成活率低，易受外界气候影响，而且易带病毒，致使植株形态畸变，产生皱缩、花叶、杂斑、条斑、植株矮小、品质变劣、品种退化等多种症状，严重时还会导致植株死亡，产量下降。至今，兰科植物的病毒病已发现30多种。常见的感染石斛的病毒有建兰花叶病毒（CyMV）和齿兰环斑病毒（ORSV）。感染CyMV病毒的石解植株叶片正反面出现黑色坏死小圆斑，叶脉间生褐色的条斑，后呈条纹状花叶，花叶症状在新叶上明显，成熟的叶上花叶症色淡，使得植株叶片发育不良或开花不正常，病患传播迅速，目前尚无有效的救治方法，一旦发现可疑植株只能立即隔离或烧毁。感染ORSV病毒的石斛，叶的坏死组织为同心圆圈或间有绿色区。圈可联合成各种形状，可使叶脱落。种苗是规模化生产的起点，是保护资源和有效利用资源的关键点，种苗的质量得到保证才能提高石斛种植和产品质量。因此，种苗脱毒具有重要的价值和意义。常用的脱毒方法有热处理脱毒法、茎尖脱毒法、热处理茎尖脱毒法等。传统的脱毒方法脱毒率低，脱毒率受茎尖大小的影响，取材困难。因此如何克服现有技术的不足是目前植物病毒防治
亟需解决的问题。
技术实现思路
为了更有效的保护即将濒危的石斛，提高种苗质量，生产无病毒种苗，本专利技术提供了一种新型的石斛超低温保存脱毒方法，能有效提高种苗脱毒率。该方法周期短，操作简便，无需复杂的设备、仪器和昂贵的药品试剂，易于推广应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种石斛超低温保存脱毒的方法，包括如下步骤：步骤（1），选择1月苗龄的带有CyMV和ORSV病毒的石斛组培苗，取石斛组培苗带有单芽的茎段1.0-1.5cm，接种到基本培养基上，在4℃黑暗条件下炼苗3-5周；所述1月苗龄是继代培养1月的石斛组培苗，苗高度为2-3cm；所述基本培养基为：1/2MS+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8；步骤（2），从步骤（1）所炼的苗上剥取1-3mm长的茎尖，然后将茎尖在4℃黑暗条件下预培养1-3d；接着在超净工作台上，采用高糖加载液对茎尖加载20-40min后，将茎尖转移到玻璃化溶液PVS2中脱水30-60min，再将茎尖投入液氮中保存30min-1h，之后将茎尖在室温下迅速转入卸载液中解冻并卸载20-30min，或是将茎尖在37℃水浴中解冻3-4min再转入卸载液中卸载20-30min，卸载后的茎尖接种到成活培养基上，先暗培养1-3d，后转入正常光照下继续培养，获得石斛脱毒苗；所述预培养的培养基为：1/2MS+0.3-0.6mol/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8；所述加载和脱水过程都在冰上进行；所述高糖加载液为：1/2MS+2mol/L甘油+0.3-0.7mol/L蔗糖，pH5.8；所述玻璃化液PVS2：1/2MS+0.4mol/L蔗糖+30%w/v甘油+15%w/vDMSOpH5.8；所述卸载液为：1/2MS+1.2mol/L蔗糖，pH5.8；所述成活培养基为：1/2MS+0.1-0.2ml/LNAA+0.1-2.0ml/L6-BA+50g/L马铃薯+25g/L香蕉+7g/L琼脂，pH5.8；所述正常光照培养是在温度25±1℃、光照强度1000-2000lx、光照12h/d的条件下进行培养。进一步，优选的是步骤（2）中在体视显微镜下剥取1-3mm长的茎尖。进一步，优选的是将茎尖投入液氮中保存时采用小滴玻璃化法或玻璃化法。进一步，优选的是所述的小滴玻璃化法是将铝箔纸剪成（0.8-1）cm*（2-2.2）cm长条形的铝箔条，将经PVS2脱水处理后的茎尖放到铝箔条光滑的一面上，向茎尖上滴加PVS2，使茎尖完全包裹于PVS2溶液小滴中，然后将铝箔条直接浸入液氮中进行冷冻，冷冻后将铝箔条装入冻存管中，拧紧盖子，最后投入液氮中保存。进一步，优选的是所述的玻璃化法是将将经PVS2脱水处理后的茎尖放入冷冻管中，向冷冻管加入PVS2使茎尖浸泡在PVS2中，盖紧盖子后直接将冷冻管投入液氮中保存。进一步，优选的是将4℃黑暗条件下预培养1-3d得到的茎尖先进行包埋，然后再加载、脱水和液氮保存；所述的包埋的具体步骤为：向茎尖上滴加海藻酸钠包埋液，使得茎尖完全包裹于海藻酸钠包埋液中，然后将含有茎尖的海藻酸钠包埋液液滴加入至钙离子包埋液中，置于室温下，使其充分凝固成包埋珠；所述的海藻酸钠包埋液为：1/2MS+0.4mol/L蔗糖+2-3.5%w/v海藻酸钠；所述的钙离子包埋液为：1/2MS+0.4mol/L蔗糖+0.1mol/l氯化钙；经过包埋后的茎尖加载时间为1.5-2h，脱水时间为4-5h，液氮保存时间为0.9-1.1h。进一步，优选的是，所述的包埋珠的直径为4-5mm。进一步，优选的是，所述的石斛超低温保存脱毒的方法，包括如下步骤：步骤（1），取1月苗龄的带有CyMV和ORSV病毒的石斛组培苗，取带有单芽的茎段1.2cm，接种到基本培养基上，在4℃黑暗条件下炼苗4周；所述1月苗龄是继代培养1月的石斛组培苗，苗高度为2-3cm；所述基本培养基为：1/2MS+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8；步骤（2），在体视显微镜下，从步骤（1）所炼的苗上剥取2mm长的茎尖，然后将茎尖在4℃黑暗条件下预培养2d；接着在超净工作台上，采用高糖加载液对茎尖加载30min后，将茎尖转移到玻璃化溶液PVS2中脱水50min，再将茎尖放到0.9cm*2.1cm的铝箔条光滑的一面上，向茎尖上滴加PVS2，使茎尖完全包裹于PVS2溶液小滴中，之后将铝箔条直接浸入液氮中进行冷冻，冷冻后将铝箔条装入冻存管中，拧紧盖子后投入液氮中保存45min，之后将茎尖在室温下转入卸载液中解冻并卸载2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种石斛超低温保存脱毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），选择1月苗龄的带有CyMV和ORSV病毒的石斛组培苗，取石斛组培苗带有单芽的茎段1.0‑1.5cm，接种到基本培养基上，在4℃黑暗条件下炼苗3‑5周；所述1月苗龄是继代培养1月的石斛组培苗，苗高度为2‑3cm；所述基本培养基为：1/2MS+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8；步骤（2），从步骤（1）所炼的苗上剥取1‑3mm长的茎尖，然后将茎尖在4℃黑暗条件下预培养1‑3d；接着在超净工作台上，采用高糖加载液对茎尖加载20‑40min后，将茎尖转移到玻璃化溶液PVS2中脱水30‑60min，再将茎尖投入液氮中保存30min‑1h，之后将茎尖在室温下迅速转入卸载液中解冻并卸载20‑30min，或是将茎尖在37℃水浴中解冻3‑4min再转入卸载液中卸载20‑30min，卸载后的茎尖接种到成活培养基上，先暗培养1‑3d，后转入正常光照下继续培养，获得石斛脱毒苗；所述预培养的培养基为：1/2MS+0.3‑0.6mol/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8；所述加载和脱水过程都在冰上进行；所述高糖加载液为：1/2MS+2mol/L甘油+0.3‑0.7mol/L蔗糖，pH5.8；所述玻璃化液PVS2：1/2MS+0.4mol/L蔗糖+30%w/v甘油+15%w/vDMSO pH5.8；所述卸载液为：1/2MS+1.2mol/L蔗糖，pH5.8；所述成活培养基为：1/2MS+0.1‑0.2ml/L NAA+0.1‑2.0ml/L 6‑BA+50g/L马铃薯+25g/L香蕉+7g/L琼脂，pH5.8；所述正常光照培养是在温度25±1℃、光照强度1000‑2000lx、光照12h/d的条件下进行培养。...

【技术特征摘要】
1.一种石斛超低温保存脱毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（1），选择1月苗龄的带有CyMV和ORSV病毒的石斛组培苗，取石斛组培苗带有单芽的茎段1.0-1.5cm，接种到基本培养基上，在4℃黑暗条件下炼苗3-5周；所述1月苗龄是继代培养1月的石斛组培苗，苗高度为2-3cm；
所述基本培养基为：1/2MS+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8；
步骤（2），从步骤（1）所炼的苗上剥取1-3mm长的茎尖，然后将茎尖在4℃黑暗条件下预培养1-3d；接着在超净工作台上，采用高糖加载液对茎尖加载20-40min后，将茎尖转移到玻璃化溶液PVS2中脱水30-60min，再将茎尖投入液氮中保存30min-1h，之后将茎尖在室温下迅速转入卸载液中解冻并卸载20-30min，或是将茎尖在37℃水浴中解冻3-4min再转入卸载液中卸载20-30min，卸载后的茎尖接种到成活培养基上，先暗培养1-3d，后转入正常光照下继续培养，获得石斛脱毒苗；
所述预培养的培养基为：1/2MS+0.3-0.6mol/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8；
所述加载和脱水过程都在冰上进行；
所述高糖加载液为：1/2MS+2mol/L甘油+0.3-0.7mol/L蔗糖，pH5.8；
所述玻璃化液PVS2：1/2MS+0.4mol/L蔗糖+30%w/v甘油+15%w/vDMSOpH5.8；
所述卸载液为：1/2MS+1.2mol/L蔗糖，pH5.8；
所述成活培养基为：1/2MS+0.1-0.2ml/LNAA+0.1-2.0ml/L6-BA+50g/L马铃薯+25g/L香蕉+7g/L琼脂，pH5.8；
所述正常光照培养是在温度25±1℃、光照强度1000-2000lx、光照12h/d的条件下进行培养。
2.根据权利要求1所述的石斛超低温保存脱毒的方法，其特征在于，步骤（2）中在体视显微镜下剥取1-3mm长的茎尖。
3.根据权利要求1所述的石斛超低温保存脱毒的方法，其特征在于，将茎尖投入液氮中保存时采用小滴玻璃化法或玻璃化法。
4.根据权利要求3所述的石斛超低温保存脱毒的方法，其特征在于，所述的小滴玻璃化法是将铝箔纸剪成（0.8-1）cm*（2-2.2）cm长条形的铝箔条，将经PVS2脱水处理后的茎尖放到铝箔条光滑的一面上，向茎尖上滴加PVS2，使茎尖完全包裹于PVS2溶液小滴中，然后将铝箔条直接浸入液氮中进行冷冻，冷冻后将铝箔条装入冻存管中，拧紧盖子，最后投入液氮中保存。
5.根据权利要求3所述的石斛超低温保存脱毒的方法，其特征在于，所述的玻璃化法是将将经PVS2脱水处理后的茎尖放入冷冻管中，向冷冻管加入PVS2使茎尖浸泡在PVS2中，盖紧盖子后直接将冷冻管投入液氮中保存。
6.根据权利要求1所述的石斛超低温保存脱毒的方法，其特征在于，将4℃黑暗条件下预培养1-3d得到的茎尖先进行包埋，然后再加载、脱水和液氮保存；
所述的包埋的具体步骤为：向茎尖上滴加海藻酸钠包埋液，使得茎尖完全包裹于海藻酸钠包埋液中，然后将含有茎尖的海藻酸钠包埋液液滴加入至钙离子包埋液中，置于室温下，使其充分凝固成包埋珠；
所述的海藻酸钠包埋液为：1/2MS+0.4mol/L蔗糖+2-3.5%w/v海藻酸钠；
所述的钙离子包埋液为：1/2MS+0.4mol/L蔗糖+0.1mol/l氯化钙；
经过包埋后的茎尖加载时间为1.5-2h，脱水时间为4-5h，液氮保存时间为0.9-1.1h。
7.根据权利要求6所述的石斛超低温保存脱毒的方法，其特征在于，所述的包埋珠的直径为4-5mm。
8.根据权利要求1所述的石斛超低温保存脱毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（1），取1月苗龄的带有CyMV和ORSV病毒的石斛组培苗，取带有单芽的茎段1.2cm，接种到基本培养基上，在4℃黑暗条件下炼苗4周；所述1月苗龄是继代培养1月的石斛组培苗，苗高度为2-3cm；
所述基本培养基为：1/2MS+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8；
步骤（2），在体视显微镜下，从步骤（1）所炼的苗上剥取2mm长的茎尖，然后将茎尖在4℃黑暗条件下预培养2d；接着在超净工作台上，采用高糖加载液对茎尖加载30min后，将茎尖转移到玻璃化溶液PVS2中脱水50min，再将茎尖放到0.9cm*2.1cm的铝箔条光滑的一面上，向茎尖上滴加PVS2，使茎尖完全包裹于PVS2溶液小滴中，之后将铝箔条直接浸入液氮中进行冷冻，冷冻后将铝箔条装入冻存管中，拧紧盖子后投入液氮中保存45min，之后将茎尖在室温下转入卸载液中解冻并卸载25min，卸载后的茎尖接种到成活培养基上，先暗培养2d，后转入正常光照下继续培养，获得石斛脱毒苗；
所述预培养的培养基为：1/2MS+0.5mol/L蔗糖...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹桦，李涵，李绅崇，闻永慧，赵培飞，杨维，李慧敏，
申请(专利权)人：云南省农业科学院花卉研究所，云南集创园艺科技有限公司，
类型：发明
国别省市：云南;53