在升高的温度下合成肽的改进偶联方法技术

本发明专利技术涉及在升高的温度下合成肽的改进偶联方法。公开了一种用于将羧酸和胺偶联的改进方法，其包括以下步骤：组合连接胺和树脂的高酸敏感性连接子、羧酸、碳二亚胺、活化剂添加剂和碱性物质；并在大于30℃的温度下进行活化和偶联。

Improved coupling method for synthesis of peptides at elevated temperatures

The present invention relates to an improved coupling method for synthesizing peptides at elevated temperatures. An improved method for carboxylic acid and amine coupling is disclosed, which comprises the following steps: connecting amine resin with high sensitivity and acid connector, carboxylic acid, imine, carbon two activator additives and alkaline substances; and the activation and coupling in greater than 30 DEG c..

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及肽合成，并特别涉及改进的固相肽合成(solidphasepeptidesynthesis,SPPS)的活化和偶联，其以更高速率进行，产生更少不期望的副反应，并且生成更好结果。
技术介绍
固相肽合成包括当另外的氨基酸被添加到生长肽链时而重复的若干基本步骤。―固相‖指起始氨基酸(之后生长肽链)附着的树脂颗粒。由于链附着到颗粒，所以链就像是固体颗粒的集合那样被处理(特别是对于洗涤和分离(例如，过滤)步骤)，并因此使整个过程在多数情况下比纯溶液合成更容易。SPPS的重复步骤包括脱保护、活化和偶联。脱保护：在各循环开始之前，肽链上最后的酸保持―被保护‖，即，其―氨基‖端连接到防止酸发生不希望反应的官能团。当即将添加下一氨基酸时该―保护基团‖由此被除去(―脱保护‖步骤)。活化：向反应中添加化合物(―活化剂‖)以生成中间氨基酸物质，其更易于偶联到肽链上脱保护的酸。偶联：活化的物质连接到已有肽链。碳二亚胺活化法或许最常使用且被研究的肽合成活化法均基于碳二亚胺的使用。它们在肽合成中的使用追溯到1955年，其中N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)被用于促进酰胺键形成。碳二亚胺包含两个弱碱性氮原子，其将与氨基酸衍生物的羧酸反应形成如图1所示的高度反应性的O-酰基异脲。然后形成的O-酰基异脲可与胺立即反应形成肽键；即，图1中水平显示的路线。可选地，O-酰基异脲可转化或被转化为其它活性物质。<br>然而，O-酰基异脲的这些可选的反应中的某一些会促进不期望的途径，其可能导致或可能不会导致肽键形成，这些不期望的途径也显示于图1中。向非反应性N-酰基脲的转化(图1中，左下方)防止偶联，而通过噁唑酮形成可发生活化的手性氨基酸的差向异构化(右下方)。通过使用与碳二亚胺相比过量的氨基酸可形成更加期望的高度反应性的对称酸酐(图1，左上方)。然而，该方法不期望地消耗额外的氨基酸当量。随着在碳二亚胺活化期间1-羟基苯并三唑(HOBt)作为添加剂的掺入，出现了碳二亚胺活化法的重大改进。HOBt迅速地将O-酰基异脲转化为高度反应性OBt酯(图1，右上方)，而避免不期望的N-酰基异脲和噁唑酮形成。随后表明1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)由于7-位氮的邻基效应而是HOBt的有利替代物[161]。许多其它添加剂可被用于代替HOBt和HOAt，列举若干常见实例，例如，6-氯代-1-羟基苯并三唑(6-Cl-HOBt)、2-氰基-2-(羟基亚氨基)乙酸乙酯(Oxyma，OxymaPure，ECHA)和1-羟基-2,5-吡咯烷二酮(NHS)。典型地，与氨基酸和碳二亚胺的量相比使用1当量的添加剂。然而，最近的研究揭示，添加剂的量降至低于1当量可能是有用的；S.Nozaki,\Delayofcouplingcausedbyexcessadditives,\J.Pept.Sci.,vol.12,pp.147-153,2006。作者发现通过胺和添加剂之间的盐形成可妨碍酰化反应。然而，作者还发现，添加剂降至低于1当量减慢了活化速率并略微增加片段偶联中的差向异构化。N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)作为优选的用于肽活化的碳二亚胺已很大程度上代替了DCC。DCC不期望地产生仅在TFA中可溶的脲，进而使其难以用于Fmoc化学。另外，DCC为难以处理并且已报道引起变态反应的蜡质固体。可选地，DIC提供改进其生成的脲在有机溶剂中的溶解度、报道的变态反应发生率更低以及相对低成本的优点。DIC/HOBt的组合由于其低成本并最小化副反应同时常规地提供有效偶联而流行。1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(―EDC‖)代表另一流行的选择，并且这些反应的大多数使用DCC、DIC和EDC的一种或多种来进行。最近对基于苯并三唑的添加剂，例如HOBt、HOAt和6-Cl-HOBt的分析，已导致它们被重分类为1类爆炸物；K.Wehrstedt,P.Wandre和D.Heitkamp,\Explosivepropertiesof1-hydroxybenzotriazoles,\J.HazardMater,vol.126,pp.1-7,2005。苯并三唑添加剂这样不期望的特点，增加了开发苯并三唑添加剂的合适替代物的兴趣，例如Oxyma(2-氰基-2-(羟基亚氨基)乙酸乙酯；首次报道于1973年(M.Itoh,\Peptides.IV.RacemizationSuppressionbytheUseofEthyl-2-Hydroximino-2-cyanoacetateandItsAmide,\Bull.Chem.Soc.Jpn.,vol.46,pp.2219-2221,1973))。更近期地，用差示扫描量热法(DSC)和加速量热法(ARC)试验了Oxyma的爆炸性质，Oxyma具有相比于HOBt更有利的结果；R.Subirós-Funosas,R.Prohens,R.Barbas,A.El-Faham和F.Albericio,\Oxyma:AnEfficientAdditiveforPeptideSynthesistoReplacetheBenzotriazole-BasedHOBtandHOAtwithaLowerRiskofExplosion,\Chemistry,vol.15,pp.9394-9403,2009。作为另一潜在的缺点，在室温合成条件下使用基于碳二亚胺的活化法，可导致基于相对慢的活化过程和更酸性的偶联环境的高水平缺陷。鎓盐活化避免DIC活化的潜在缺点已导致基于鎓盐的活化方法更近期的发展。基于鎓盐的活化要求使用碱性物质首先使羧酸去质子化，生成羧酸根阴离子，羧酸根阴离子反过来与鎓盐活化剂反应的。多种鎓盐--其中，O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)；2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)；(苯并三-1-基氧基)三吡咯烷鏻六氟磷酸盐(PyBOP)；(3-羟基-3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶根合-O)三-1-吡咯烷基-磷六氟磷酸盐(PyAOP)；和2-(6-氯代-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基铵六氟磷酸盐(HCTU)--已表明相比于室温条件下基于碳二亚胺的活化的改进的偶联。图2说明基于鎓盐的活化途径。在碳二亚胺型活化时使用碱性物质在少数报道中，已在室温偶联条件下研究了在基于碳二亚胺的偶联期间碱性物质的存在。Beyermann本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种将羧酸与胺偶联的方法，其改进包括：组合连接胺和树脂的高酸敏感性连接子、羧酸、碳二亚胺、活化剂添加剂和碱性物质；和在大于30℃的温度下进行活化和偶联。

【技术特征摘要】
2014.12.19 US 62/094,420;2015.02.04 US 62/111,817;1.一种将羧酸与胺偶联的方法，其改进包括：
组合连接胺和树脂的高酸敏感性连接子、羧酸、碳二亚胺、活化剂添加
剂和碱性物质；和
在大于30℃的温度下进行活化和偶联。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述连接子将氨基酸连接至所述树
脂。
3.根据权利要求1所述的方法，其包括，以相比于欲活化的羧酸小于1
当量的量组合所述碱性物质。
4.根据权利要求3所述的方法，其中基于存在的氨基酸的量，所述碱性
物质的量不超过0.2当量。
5.根据权利要求1所述的方法，其中基于存在的羧酸的量，所述碱性物
质的量不超过0.1当量。
6.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述连接子选自由2-氯三
苯甲基和三苯甲基组成的组。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述连接子将肽连接至所述树脂。
8.根据前述权利要求任一项所述的方法，其在小于10分钟的总偶联时间
内进行。
9.根据前述权利要求任一项所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·M·柯林斯，S·K·辛格，
申请(专利权)人：CEM有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US