同时生产L-氨基酸及核黄素的微生物及使用其生产L-氨基酸及核黄素的方法技术

技术编号:15096579 阅读:159 留言:0更新日期:2017-04-07 23:26
本发明专利技术涉及一种同时生产高浓度的L-氨基酸及核黄素的方法,及同时生产L-氨基酸及核黄素的微生物,具体地,在具有L-赖氨酸或L-苏氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物中,对含有核黄素生物合成基因簇的rib操纵子表达的酶群进行活性强化,从而提供一种修饰的、能够同时生产L-赖氨酸或L-苏氨酸,及核黄素的变异型微生物;利用所述微生物同时生产L-赖氨酸或L-苏氨酸,及核黄素的方法;及由所述变异型微生物培养液制备的包含L-赖氨酸或L-苏氨酸,及核黄素的制剂或颗粒制剂、饲料及饲料添加剂。

Microorganism for simultaneous production of L- amino acid and riboflavin and method for producing L- amino acid and riboflavin using the same

The present invention relates to a method and a L- amino acid and riboflavin production of high concentration, and simultaneous production of L- amino acid and riboflavin microorganisms, in particular, with Corynebacterium L- lysine or threonine L- production capacity of microorganisms of the genus, the expression of the rib biosynthetic gene cluster containing Riboflavin Operon enzyme activity enhancement group thus, a modified, capable of simultaneously producing L- lysine or threonine L-, variant microorganism and riboflavin; lysine or threonine L- and L- production by using the method of microorganism, and riboflavin; and by the variation of microbial culture liquid preparation containing L- lysine or L- threonine, preparation or granule preparation, feed and feed additives and riboflavin.

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请日为2012年11月16日、专利技术名称为“同时生产L-氨基酸及核黄素的微生物及使用其生产L-氨基酸及核黄素的方法”的中国专利申请No.201210466348.0的分案申请。本申请要求于2011年12月1日在韩国知识产权局提交的韩国专利申请No.10-2011-0127955的权益。
本专利技术涉及一种同时生产高浓度的L-氨基酸及核黄素的方法及同时生产L-氨基酸及核黄素的微生物。
技术介绍
玉米、高粱、大麦、小麦等谷类饲料作为饲料中利用最多的原料,一般情况下,其提供氨基酸需求量的30~60%。因此,为了满足剩余的需求量,并维持氨基酸之间的均衡,需要进一步供给氨基酸。此外,在所有的饲料中含有一定程度的维生素,不论哪一种维生素,如果不供给充分的量,就会产生缺乏症状。因此,维生素与氨基酸一样,需要进一步供给,才能够维持适当的含量。在饲料成分中,氨基酸是最贵的供应源,因此可以认为,有效地供应氨基酸是影响整体生产效率的因素之一。特别是,在所述氨基酸中,L-赖氨酸及L-苏氨酸对家畜的生长成为第一限制性必需氨基酸的情况很多。利用微生物的发酵法生产所述L-赖氨酸及L-苏氨酸,由所述发酵法生产的L-赖氨酸及L-苏氨酸在精制及浓缩后,添加到饲料中。用于发酵L-赖氨酸的微生物,其中以棒状杆菌属微生物(Corynebacteriumsp.)或埃希氏杆菌(Escherichia.coli)为代表,有很多关于对所述微生物进行基因操作,从而生产L-赖氨酸的报道(韩国授权专利第10-0930203号、第10-0924065号、美国专利第7,871,801号)。目前,正在使用遗传工程学的方法,对微生物进行改良,为提高L-赖氨酸或L-苏氨酸的产量而不断努力,但随着工业的发展,需要更多量的L-赖氨酸或L-苏氨酸,因此,正在继续努力开发能够更有效、经济地生产L-赖氨酸或L-苏氨酸的方法。虽然维生素的需求量很小,但维生素是用于维持家畜正常代谢功能、生长、繁殖功能,以及维持健康所必需提供的有机化合物。在所述维生素中,核黄素(B2)是一种水溶性维生素,在各种微生物和所有植物中能够生物合成核黄素,但在包括人类的脊椎动物的体内,具有无法生物合成的特性,因此需要从外部供给。如果猪缺乏所述核黄素的情况下,则会诱发性欲缺失和母猪的繁殖障碍(繁殖生物学(1981)25:659-665,动物科学杂志(1984)59:1567-1572(Biol.Reprod.(1981)25:659-665,J.Anim.Sci.(1984)59:1567-1572)),鸡的情况下,会引起神经方面的问题,特别是会引起坐骨及上臂神经的问题,还会对胚胎(embryo)的发育产生不良影响,导致胚胎死亡(韩国饲养标准,家禽,2002,农林部)。因此,所述核黄素一直以来被用作家畜生长的饲料添加剂,特别是浓缩状态的核黄素本身一直作为饲料使用。目前全球核黄素的产量规模为每年6000吨,其中,75%左右作为饲料添加剂使用,其余部分用于食品及医药用品领域。作为生产核黄素的方法,一直在联合使用化学合成法和利用微生物的发酵法。化学合成法,其大体上是利用D-核糖等前体物质,经过多步骤工艺来生产高纯度核黄素的方法。所述化学合成法的起始物质价格昂贵,因此存在生产费用高的缺点,由此,开发了利用微生物的发酵法。利用微生物的发酵法,是从自然界分离出生产核黄素的微生物或使用遗传工程学方法或化学-物理方法诱导出变异的微生物,以使其过量生产核黄素,然后将上述微生物在适宜的条件下培养后,从发酵液中分离核黄素的方法。由于发酵法具备成本竞争力,且对环境友好,因此最近成为了主要研究对象,通过所述发酵法生产的核黄素经过精制及浓缩后,将其添加到饲料中。作为代表,公开有利用作为酵母的无名假丝酵母(Candidafamata)生产核黄素的方法(美国专利第5,231,007号),在核黄素的工业化生产中,作为子囊菌的阿氏假囊酵母(Eremotheciumashbyii)和棉阿舒囊霉(Ashbyagossypii;国际专利公开第9526406号)是使用最多的菌株。作为细菌,报道有枯草杆菌(Bacillussubtilis),还有很多将所述细菌进行基因操作,生产核黄素的例子(欧洲专利第0821063号、美国专利第5,837,528号、美国专利第5,334,510号)。本专利技术人也曾利用上述细菌生产过核黄素(韩国授权专利第10-0542573号)。此外,还报道有通过操作,使关于核黄素生物合成的酶基因过量表达,从而生产出4.5g/L的核黄素的例子(工业微生物学及生物技术杂志(1999),22:8-8(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)1999),22:8-8))。在动物饲料中,各成分的需求量按照以下标准供应。L-赖氨酸约为1~5g/kg、L-苏氨酸约为0.6~3.3g/kg、核黄素约为2~4mg/kg,其是L-赖氨酸的约0.1%(美国全国科学研究委员会.1998.美国国家科学院-国家研究委员会,华盛顿哥伦比亚特区(NRC.1998.NationalAcademyofSciences-NationalResearchCouncil,Washington,D.C.))。但是,所述L-赖氨酸及核黄素分别用发酵法单独生产,在添加到饲料之前经过精制及浓缩过程,再分别运送到配合饲料工厂,因此会制定很高的饲料成本。如果,同时生产L-赖氨酸及核黄素的微生物中,核黄素的浓度达到L-赖氨酸浓度的约0.1%左右,则可以通过添加所述微生物的培养液来满足饲料添加剂的基准需求量,但至今尚无对这种设想的报告。棒状杆菌属微生物的情况下,核黄素由磷酸戊糖途径(pentose-phosphatepathway,PPP)产物之一的核酮糖5-磷酸(ribulose5-phosphate,Ru5P)和嘌呤途径(purimemetabolism)产物之一的三磷酸鸟苷(Guanosinetriphosphate,GTP),通过两种途径进行生物合成,由三磷酸鸟苷酸环化水解酶II(GTPcyclohydrolaseII,RibA)基因、嘧啶脱氨基酶-还原酶(pyrimidinedeaminase-reductase,RibG)基因、核黄素合酶α亚基(Riboflavinsynthasesubunitalpha,RibC)基因及核黄素合酶β亚基(riboflavins本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种颗粒制剂,其特征在于,其通过以下步骤制得:a)在具有L‑赖氨酸或L‑苏氨酸生产能力的谷氨酸棒状杆菌微生物中,培养修饰的上述微生物,以使核黄素的产量增加,从而用发酵法同时生产L‑赖氨酸或L‑苏氨酸,及核黄素,其中,对含有核黄素生物合成基因簇的rib操纵子表达的酶群进行活性强化,来使核黄素的产量增加,并且其中,所述对rib操纵子表达的酶群进行活性强化的方法选自以下方法中的一种以上:增加所述核黄素生物合成基因簇或所述rib操纵子的基因的细胞内拷贝数;向所述rib操纵子的调控序列导入变异;将所述rib操纵子的调控序列替换为活性强的序列;将所述rib操纵子的染色体基因替换为突变的基因,以增加所述酶群的活性;及向所述rib操纵子的染色体基因中导入变异,以强化所述酶群的活性;以及b)将含有所述步骤a)的L‑赖氨酸或L‑苏氨酸,以及核黄素的发酵液进行颗粒化。

【技术特征摘要】
2011.12.01 KR 10-2011-01279551.一种颗粒制剂,其特征在于,其通过以下步骤制得:
a)在具有L-赖氨酸或L-苏氨酸生产能力的谷氨酸棒状杆菌微生
物中,培养修饰的上述微生物,以使核黄素的产量增加,从而用发酵
法同时生产L-赖氨酸或L-苏氨酸,及核黄素,
其中,对含有核黄素生物合成基因簇的rib操纵子表达的酶群进
行活性强化,来使核黄素的产量增加,并且其中,所述对rib操纵子
表达的酶群进行活性强化的方法选自以下方法中的一种以上:增加所
述核黄素生物合成基因簇或所述rib操纵子的基因的细胞内拷贝数;
向所述rib操纵子的调控序列导入变异;将所述rib操纵子的调控序
列替换为活性强的序列;将所述rib操纵子的染色体基因替换为突变
的基因,以增加所述酶群的活性;及向所述rib操纵子的染色体基因
中导入变异,以强化所述酶群的活性;以及
b)将含有所述步骤a)的L-赖氨酸或L-苏氨酸,以及核黄素的
发酵液进行颗粒化。
2.根据权利要求1所述的颗粒制剂,其特征在于,所述L-赖氨
酸或L-苏氨酸:核黄素的比例为1:0.0001~0.01。
3.根据权利要求1或2所述的颗粒制剂,其特征在于,还包括
从含有所述步骤a)中生产的L-赖氨酸或L-苏氨酸及核黄素的发酵培
养液中,去...

【专利技术属性】
技术研发人员:朴相喜文准玉林相曹权刀显李庚翰成珍锡金亨俊
申请(专利权)人:CJ第一制糖株式会社
类型:发明
国别省市:韩国;KR

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