一个受温度调控水稻叶色基因及其检测方法和应用技术

本发明专利技术涉及一个受温度调控水稻叶色的基因及其检测方法和应用。本发明专利技术公开了一个受温度调控水稻叶色的基因，具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，该基因编码的蛋白质具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。利用设计一对SEQ ID No.3和SEQ ID No.4特异性PCR引物，对水稻中所提取的DNA进行PCR扩增后，经EcoRII酶切后再经过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，即可快速有效的检测到含有该基因的水稻植株，具有检测精确度高，操作方便，成本低廉等特点。携带该基因的水稻植株在低温下表现黄化苗。本发明专利技术得到的受温度调控水稻叶色基因可应用到杂交水稻制种，可提高杂交水稻不育系本身及其它配制杂交水稻的纯度。

Rice leaf color gene regulated by temperature and detection method and application thereof

The present invention relates to a gene regulated by temperature, and its detection method and application. The invention discloses a temperature regulation of rice leaf color gene, has the nucleotide sequence of SEQ ID as shown in No.1, the gene encoding the protein with the amino acid sequence of SEQ ID No.2 shown. The design of SEQ ID and SEQ No.3 ID No.4 specific PCR primers for PCR amplification of the extracted rice DNA after digested by EcoRII after agarose gel electrophoresis for identification, rapid and effective detection to rice plants containing the gene, has high detection precision and operation convenient, low cost etc.. The rice plants carrying this gene showed etiolated seedlings at low temperature. The rice leaf color gene regulated by the temperature can be applied to the hybrid rice seed production, and the purity of the hybrid rice sterile line and other hybrid rice can be improved.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及农业和植物生物技术等领域，尤其是在分子水平进行水稻遗传育种以及生理、基因功能等基础研究。技术背景叶片是植物进行光合作用的主要器官，类型丰富且易于鉴别，所以叶色是辨别植物突变最直观的标准之一。在实际应用中，叶色不仅可用于观赏植物新特品种的选育，还可以作为很多农作物如水稻、小麦、玉米等的最理想的形态学标记，还可用于植物的遗传、生理及其相关基因的克隆和功能研究。目前，研究工作者们利用物理、化学、生物等技术已创制大量水稻叶色突变体，根据它们是否受温度调控，又分为高温表达型、低温表达型和温度钝感型等的叶色突变体。本研究利用60Coγ射线诱变处理创制的受低温度调控水稻叶色的突变株，并通过图位克隆技术定位到一个受温度调控水稻叶色新基因。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一个受温度调控水稻叶色的基因、该基因编码的蛋白质及这种基因的检测方法和应用。受温度调控叶色变化的水稻来源于经60Coγ射线处理的粳稻嘉花1号的诱变产生的群体后代，经多次自交繁殖和选择，该水稻性状和各种农艺性状均已稳定。以该水稻材料与籼稻9311杂交的F2代分离群体作为定位群体，利用DNA分子标记将受温度调控水稻叶色的基因定位在水稻第1号染色体上。携带该受温度调控叶色的基因水稻植株在27.5℃以下生长的条件下表现出苗色黄化。该基因，具有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。所述的基因编码的蛋白质，具有SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。一对用于检测上述基因的特异性dCAPs引物，序列为：上游：5’-CTTGGCTACTTGCTGATAGGTAACTTACCCCCTG-3’下游：5’-CAGGCCTCCATAGAAGGAGGCCAAA-3’即SEQIDNo.3和SEQIDNo.4检测该受温度调控水稻叶色基因的方法为，采用上述特异性（SEQIDNo.3和SEQIDNo.4）对水稻提取DNA进行扩增，得到208bp核苷酸序列。SEQIDNo.5和SEQIDNo.6的序列分为野生型水稻（嘉花1号）和携带受温度调控叶色基因水稻的所示。由携带受温度调控叶色基因的水稻DNA扩增得到的208bp片段不含EcoRII酶的内切位点，不被EcoRII切断，而由野生型水稻扩增所得到的208bp片段能切成30bp和178bp的两个特异性片段。在本专利技术中，专利技术人设计了在受温度调控叶色该基因片段与野生型嘉花1号相差一个碱基的特异性dCAPs引物，引入的错配碱基可以引入的限制性酶切位点，从而可以在此208bp核苷酸序列中EcoRII酶切野生型(嘉花1号)水稻，但不切断携带受温度调控叶色基因的水稻，根据酶切带型能快速检测到含有此基因的水稻品种，其检测精确度高，操作方便，成本低廉。附图说明图1为本专利技术野生型水稻（左）与具有受温度调控叶色的基因水稻（右）在27.5℃苗期表型；图2为本专利技术对PCR的dCAPs引物扩增产物进行EcoRII酶切检查结果。具体实施方式实施例1水稻DNA提取1.取新鲜的苗期水稻叶片，将叶片剪成0.5cm长的小段，放入预冷的研钵中，加入液氮将其研磨至粉末状，转入2ml离心管中加入1ml60℃预热的2×CTAB（破坏细胞膜），轻轻震荡后60℃水浴45min,期间多次震荡。2.取出离心管，冷却至室温，12000r/min20℃条件下离心5min，吸取600μl上清液,并加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1）混合液，充分混匀。3.将含有溶液的离心管进行平衡，12000r/min20℃离心5min，吸取600μl上清液，加入其2/3体积（400μl）异丙醇，轻轻混匀使核酸析出。4.12000r/min20℃离心3min,使核酸沉淀，弃上清。5.加入70%乙醇洗涤，12000r/min20℃离心5min，弃上清。6.重复步骤5。7.室温干燥后溶于10μl的无菌水中。8.取2μl用于后续的PCR扩增反应。实施例2（一）获得受温度调控水稻叶色的基因及其氨基酸序列1.25μlPCR反应体系如下：100MmTris-HClpH9.0;100mMKCl;20mMMgSO4;80mM(NH4)SO4;2.5MmDntp;10μM引物，5U/μlTaq酶，1μl模板DNA。引物序列为：上游：5’-CACCGCCTGCCCACCGACGACGATG-3’下游：5’-GAAGATGCCATTTCAGTCAC-3'PCR扩增反应反应条件：PCR扩增产物长度为3446bp,用Bioxm软件与http://rice.plantbiology.msu.edu/网页下载得到的基因序列与测序结果比对，舍去其它片段结果如SEQIDNo.1。参照KOME网站上获得的ORF序列，设计特异性RT-PCR引物，上游端和下游端分别为:5’-ATGGAGCTTCGACATAAAACGGGGA-3’5’-AGTTCAATTCTCCAACATCACTTCC-3’对所提取的正常植株总cDNA进行扩增，其目的片段长度为1146bp，并进行测序。将测序得到的DNA序列即ORF,利用Bioxm软件翻译成381个氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。（二）检测受温度调控水稻叶色的基因1.25μlPCR反应体系如下：100MmTris-HClpH9.0;100mMKCl;20mMMgSO4;80mM(NH4)SO4;2.5MmDntp;10μM引物，5U/μlTaq酶，1μl模板DNA。特异性PCR引物序列如下：上游：5’-CTTGGCTACTTGCTGATAGGTAACTTACCCCCTG-3’下游：5’-CAGGCCTCCATAGAAGGAGGCCAAA-3’2.PCR扩增反应。反应条件：得到的扩增产物，经溴酚蓝染色，上样于经溴化乙锭染色的2%的琼脂糖凝胶上并电泳，在UVP凝胶成像仪上成像，结果如图2所示，出现208bp条带，序列如SEQIDNo.3所示，是SEQIDNo.1中的一段。3.酶切反应体系34μl无菌水,5μl10×EcoRIIBuffer,1μl10U/μlEcoRII和10μlPCR扩增产物。4.酶切处理将酶切反应体系混匀后，放入37℃恒温水浴中，温水浴2小时，每管加入1μl10×Loadingbuffer终止酶切反应，将扩增产物，经溴酚蓝染色，上样于经溴化乙锭染色的5%琼脂糖凝胶上并电泳，在UVP凝胶成像仪上成像。结果如图2所示。其酶切带型为出现两个特异性片段，长度为30bp和178bp，由于30本文档来自技高网...

【技术保护点】
一个受温度调控水稻叶色基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
2016.01.28 CN 20161005774651.一个受温度调控水稻叶色基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。
2.根据权利要求1所述的一个受温度调控水稻叶色基因，其特征在于所述的基因序列
所编码的蛋白质为SEQIDNo.2所示的381个氨基酸序列。
3.一种用于检测权利要求1所述的受温度调控水稻叶色基因的特异性dCAPsPCR引物，
其特征在于，其核苷酸序列为：
上游：5’-CTTGGCTACTTGCTGATAGGTAACTTACCCCCTG-3’（SEQIDNo.3）
下游：5’-CAGGCCTCCATAGAAGGAGGCCAAA-3’（SEQIDNo.4）。
4.一种用于检测权利要求1所述的受温度调控水稻叶色基因的方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵怀玉，江泉，陈佳颖，林琛，林冬芝，董彦君，
申请(专利权)人：上海师范大学，
类型：发明
国别省市：上海;31