用于检测多种呼吸道病毒的PCR引物组、探针组及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了用于检测多种呼吸道病毒的PCR引物组、探针组及试剂盒；其中所述PCR引物的各序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.18，所述探针包括两端分别带有荧光基团和淬灭基团的9条呼吸道病毒的分子信标探针中的至少两条，各序列为SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.27。本发明专利技术还公开包含以上PCR引物和探针的PCR反应液，以及包含至少一人份PCR反应液的试剂盒。利用本发明专利技术，可以快速准确地分型检测9种呼吸道病毒。

PCR primer set, probe set and kit for detecting multiple respiratory viruses

The invention discloses a primer for PCR group, probe group and kit for detection of a variety of respiratory viruses; the sequence of the PCR primers for SEQ ID NO.1 ~ SEQ ID NO.18, molecular beacon probe 9 respiratory viruses including the probe ends with a fluorophore and quencher. In at least two, the sequence of SEQ ID NO.19 ~ SEQ ID NO.27. The invention also discloses a PCR reaction liquid contains more than PCR primers and probes, and contains at least one person reaction PCR kit. By using the invention, the 9 types of respiratory viruses can be detected quickly and accurately.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用于检测多种呼吸道病毒的PCR引物组、探针组及试剂盒。
技术介绍
呼吸道感染是临床最常见的疾病之一，可由多种病原体引起，其中包括细菌、病毒、支原体、衣原体等。其中急性呼吸道感染(AcuteRespiratoryTractInfection，ARTI)是世界范围内导致儿童患病和死亡的重要原因。世界卫生组织(WHO)2005年在《柳叶刀》杂志发表文章报道：在2000-2003年，每年1060万5岁以下死亡儿童中，因传染性疾病死亡占54％，其中因肺炎死亡的患儿占19％。ARTI的严格定义是所有的呼吸道感染，然而，实际上，在严重呼吸道疾病中急性下呼吸道占据大多数，占世界范围内学龄前儿童死亡总数的20％，其中90％为肺炎。大量的证据表明，营养不良、低出生体重、被动吸烟、人工喂养、经济困难、居住环境拥挤、免疫功能缺陷、HIV感染是严重ARTI的危险因素，因此，大多数因急性呼吸道感染死亡的病例发生在发展中国家。ARTI主要的致病微生物包括细菌和病毒，还包括一些非典型病原体，如真菌、支原体、衣原体等，根据临床症状和影像报告临床工作者很难将它们区分，因此病原分析对于临床诊断和治疗至关重要。传统检测呼吸道病原体的方法主要有培养方法、生化方法和免疫方法等，培养法操作复杂，检测周期长、费用高，不适合作为临床样品的常规检测。生化检测方法操作简单、快速，费用低，是目前门诊检验的常规检测方法；但该方法灵敏度和特异性不高，影响因素多，不能区分病原体的具体种类。免疫检测方法快速简便；但一个检测只能针对其中一种病原体。随着医疗水平的发展，用上述传统的方法已经不能满足对呼吸道病原体的检测，临床上需要一种能够灵敏、特异，并且快速、简便的呼吸道多病原体鉴定检测方法，以便能够更好的做到个体化的治疗、并满足对卫生防疫和疫情控制、进行传染病流行病学研究的需求。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提出一种准确、快速、灵敏的用于检测多种呼吸道病毒的PCR引物组、探针组、PCR反应液及试剂盒。其中，所述PCR引物组包括以下至少两对引物对：由序列表中SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的两条序列组成的针对甲型流感病毒的引物对；由序列表中SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的两条序列组成的针对乙型流感病毒的引物对；由序列表中SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示的两条序列组成的针对呼吸道合胞病毒的引物对；由序列表中SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示的两条序列组成的针对I型副流感病毒的引物对；由序列表中SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示的两条序列组成的针对II型副流感病毒的引物对；由序列表中SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示的两条序列组成的针对III型副流感病毒的引物对；由序列表中SEQIDNO.13和SEQIDNO.14所示的两条序列组成的针对冠状病毒的引物对；由序列表中SEQIDNO.15和SEQIDNO.16所示的两条序列组成的针对C型鼻病毒的引物对；由序列表中SEQIDNO.17和SEQIDNO.18所示的两条序列组成的针对人偏肺病毒的引物对。所述探针组包括以下至少两条分子信标探针：由序列表中SEQIDNO.19所示的序列或其反向互补序列组成的针对甲型流感病毒的分子信标探针；由序列表中SEQIDNO.20所示的序列或其反向互补序列组成的针对乙型流感病毒的分子信标探针；由序列表中SEQIDNO.21所示的序列或其反向互补序列组成的针对呼吸道合胞病毒的分子信标探针；由序列表中SEQIDNO.22所示的序列或其反向互补序列组成的针对I型副流感病毒的分子信标探针；由序列表中SEQIDNO.23所示的序列或其反向互补序列组成的针对II型副流感病毒的分子信标探针；由序列表中SEQIDNO.24所示的序列或其反向互补序列组成的针对III型副流感病毒的分子信标探针；由序列表中SEQIDNO.25所示的序列或其反向互补序列组成的针对冠状病毒的分子信标探针；由序列表中SEQIDNO.26所示的序列或其反向互补序列组成的针对C型鼻病毒的分子信标探针；由序列表中SEQIDNO.27所示的序列或其反向互补序列组成的针对人偏肺病毒的分子信标探针；每一条分子信标探针的两端分别带有荧光基团和淬灭基团。优选地，每一条所述分子信标探针的整体为茎环结构，两端为互补的茎结构，中间为与对应呼吸道病毒扩增产物特异杂交的环状结构。优选地，每一条所述分子信标探针的熔解温度范围在55℃～80℃，至少两条所述分子信标探针中若具有相同的荧光基团，则具有相同荧光基团标记的分子信标探针的Tm设计成一定的梯度，差异在2℃以上。优选地，所述荧光基团选自FAM、HEX和TAMRA，所述淬灭基团为Dabcyl。其中，所述PCR反应液，包含所述的PCR引物组和对应的所述的探针组所述的试剂盒包括至少一人份所述的PCR反应液。本专利技术的有益效果包括：采用本专利技术的技术方案，可以检测并鉴别多种呼吸道病毒，而且该方法操作简便、检测准确、灵敏、快速，4小时内可出结果。本专利技术利用多重RT-PCR荧光分子信标熔解曲线技术，PCR扩增后直接对产物进行熔解曲线分析，无需开盖分析，可有效避免产物污染；多色荧光和熔解曲线相结合，保证了检测的足够通量，可进行多种呼吸道病毒的分型检测，应用分子信标探针技术，检测的特异性高，成本较低，适合在临床大量推广使用。附图说明图1为本专利技术具体实施方式中的甲型流感病毒(Flu-A)、乙型流感病毒(Flu-B)、呼吸道合胞病毒(RSV)的FAM荧光熔解曲线图；图2为本专利技术具体实施方式中的I型副流感病毒(PIV-I)、II型副流感病毒(PIV-II)、III型副流感病毒(PIV-III)的HEX荧光熔解曲线图；图3为本专利技术具体实施方式中的冠状病毒(CoV)、C型鼻病毒(HRV-C)、人偏肺病毒(HMPV)的TAMRA荧光熔解曲线图。具体实施方式本专利技术涉及对多种呼吸道病毒分型检测的PCR引物组、探针组、PCR反应液及试剂盒。下面结合具体实施方式及附图对本专利技术作进一步详细说明。应该强调的是，下述说明仅仅是示例性的，而不是为了限制本专利技术的范围及其应用。根据本专利技术的实施例，对多种呼吸道病毒检测的PCR引物组、探针组、PCR反应液及试剂盒将用于以下9种呼吸道病毒中的至少2种的分型检测，分别为：甲型流感病毒、乙型流感本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测多种呼吸道病毒的PCR引物组，其特征在于，所述PCR引物组包括以下至少两对引物对：由序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的两条序列组成的针对甲型流感病毒的引物对；由序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的两条序列组成的针对乙型流感病毒的引物对；由序列表中SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的两条序列组成的针对呼吸道合胞病毒的引物对；由序列表中SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的两条序列组成的针对I型副流感病毒的引物对；由序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的两条序列组成的针对II型副流感病毒的引物对；由序列表中SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的两条序列组成的针对III型副流感病毒的引物对；由序列表中SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的两条序列组成的针对冠状病毒的引物对；由序列表中SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示的两条序列组成的针对C型鼻病毒的引物对；由序列表中SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示的两条序列组成的针对人偏肺病毒的引物对。...

【技术特征摘要】
1.用于检测多种呼吸道病毒的PCR引物组，其特征在于，所述PCR引物组包括
以下至少两对引物对：
由序列表中SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的两条序列组成的针对甲型流感
病毒的引物对；
由序列表中SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的两条序列组成的针对乙型流感病
毒的引物对；
由序列表中SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示的两条序列组成的针对呼吸道合胞
病毒的引物对；
由序列表中SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示的两条序列组成的针对I型副流感
病毒的引物对；
由序列表中SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示的两条序列组成的针对II型副流
感病毒的引物对；
由序列表中SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示的两条序列组成的针对III型副
流感病毒的引物对；
由序列表中SEQIDNO.13和SEQIDNO.14所示的两条序列组成的针对冠状病毒
的引物对；
由序列表中SEQIDNO.15和SEQIDNO.16所示的两条序列组成的针对C型鼻病
毒的引物对；
由序列表中SEQIDNO.17和SEQIDNO.18所示的两条序列组成的针对人偏肺病
毒的引物对。
2.用于检测多种呼吸道病毒的探针组，其特征在于，所述探针组包括以下至少两
条分子信标探针：
由序列表中SEQIDNO.19所示的序列或其反向互补序列组成的针对甲型流感病
毒的分子信标探针；
由序列表中SEQIDNO.20所示的序列或其反向互补序列组成的针对乙型流感病
毒的分子信标探针；
由序列表中SEQIDNO.21所示的序列或其反向互补序列组成的针对呼吸道合胞
病毒的分子信标探针；

【专利技术属性】
技术研发人员：廖生赟，魏凤香，
申请(专利权)人：深圳市亿立方生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44