本发明专利技术涉及一种能够低成本合成DNA的方法,步骤包括:提供寡核苷酸池,所述寡核苷酸池中含有至少两种寡核苷酸;采用PCR方法,从寡核苷酸池中取出所需寡核苷酸序列组,并将所取出的寡核苷酸序列生成双链DNA;将双链DNA进行酶切,在所述双链DNA末端形成互补的粘性末端;将切割后的DNA片段进行连接;利用PCR方法对连接产物进行扩增,并在连接产物末端引入随机序列;高通量DNA测序,筛选出正确的DNA序列。本发明专利技术中,在利用芯片等高通量制备的寡核苷酸进行DNA合成之后,引入高通量测序的方法对合成得到的每一条序列进行测序验证;本发明专利技术方法极大地结合了“芯片等高通量制备寡核苷酸的低成本”和“高通量测序解决高错误率”的优势,极大地降低了合成DNA的成本和费用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种DNA合成方法,尤其涉及一种能够低成本合成DNA的方法。
技术介绍
DNA合成技术的专利技术极大地推动了合成生物学领域的进展,而随着合成生物学的深入发展,对DNA合成技术也提出了更多的挑战和要求。目前,随着高通量DNA测序技术的飞速发展,DNA测序的成本已经急剧下降,极大地推动了科研、医疗和生物技术等领域的发展。相比之下,DNA合成的成本却一直居高不下。为了降低合成成本,人们做出大量的努力,但是成本下降程度依然有限。目前,在DNA合成中的主要成本之一是引物(或者寡核苷酸)的成本,例如,目前每个核苷酸的市场价格约为0.9元人民币。同时,用化学法合成的寡核苷酸不可避免地存在错误率,例如,大约有1/100概率会丢失核苷酸和1/400概率会插入非目标核苷酸。寡核苷酸中的错误会直接导致合成的DNA(或者基因)片段中带有大量的错误,并需要进行各种除错和测序验证的步骤,进一步增加了合成的成本。以现有市场上流行的合成方法来计算,由于各个步骤的成本(包括寡核苷酸成本、除错成本、克隆成本、测序成本和人力等成本)难以降低,所以造成了DNA合成的费用一直高居不下,也阻碍了生物相关行业的发展。近年来,芯片合成寡核苷酸的技术得到了快速的发展,大大降低了寡核苷酸合成的成本(例如美国CustomArrayInc公司提供的合成价格折算下来,每个核苷酸不到0.3分)。目前,科学家们已经成功地利用芯片制备的寡核苷酸进行大片段DNA的合成(ZhouX.,CaiS.,etal.,NucleicAcidsRes.,2004,32(18):5409-5417;BorovkovA.Y.,LoskutovA.V.,etal.,NucleicAcidsRes.,2010,38(19):e180;MatzasM.,StahlerP.F.,etal.,Nat.Biotechnol.,2010,28(12):1291-1294;EroshenkoN.,KosuriS.,etal.,Curr.Protoc.Chem.,2012)。然而,由于芯片制备的寡核苷酸的错误率通常更高,用芯片制备的寡核苷酸进行DNA合成时,需要花费更多的精力来进行后续的除错(SaaemI.,MaS.,etal.,NucleicAcidsRes.,2012,40(3):e23;WanW.,LiL.,etal.,NucleicAcidsRes.,2014,42(12):e102)、测序筛选等步骤。也有一些方法来降低芯片制备的寡核苷酸的错误率,例如用高通量测序的方法从制备的寡核苷酸池中挑取正确的目的寡核苷酸用于后续的DNA合成(MatzasM.,StahlerP.F.,etal.,Nat.Biotechnol.,2010,28(12):1291-1294;SchwartzJ.J.,LeeC.,etal.,Nat.Methods,2012,9(9):913-915),但是该方法的成本往往更高。同时,由于芯片制备寡核苷酸的特点是通量高(例如,美国CustomArrayInc公司提供12k和90k两种规模),常规DNA(或基因)合成的方法无法使用芯片制备的寡核苷酸;因此,芯片制备的寡核苷酸一般被加上标签,分为不同的组,然后利用特定的标签用PCR方法将各组寡核苷酸提取出来,进行后续的DNA(基因)合成(EroshenkoN.,KosuriS.,etal.,Curr.Protoc.Chem.,2012)。这些操作都无疑增加了DNA合成的成本。因此,综合计算,该方法并没有大幅度降低基因合成的成本,因此目前也没有被商业公司广泛采用。
技术实现思路
针对现有技术方案合成DNA成本较高的问题,本专利技术提供了一种新的合成DNA的方法。本专利技术第一个方面是提供一种合成DNA的方法,所述合成DNA的方法的步骤包括:提供寡核苷酸池,所述寡核苷酸池中含有至少两种寡核苷酸;采用PCR方法,从寡核苷酸池中取出所需寡核苷酸序列组,并将所取出的寡核苷酸序列生成双链DNA;将双链DNA进行酶切,在所述双链DNA末端形成互补的粘性末端(cohesiveend);将切割后的DNA片段进行连接;高通量DNA测序,筛选出正确的DNA序列。本专利技术第二个方面是提供另一种合成DNA的方法,所述合成DNA的方法的步骤包括:提供寡核苷酸,所述寡核苷酸两端分别连接有标签DNA序列,得到寡核苷酸池;其中,所述寡核苷酸序列结构如下:TagF-E1-S-E2-TagR其中,TagF和TagR分别为两端的标签DNA序列,其特异性标记靶标DNA;E1和E2为酶切位点,S为靶标DNA序列;各个寡核苷酸序列中的E1和E2可以相同或不同,各个寡核苷酸序列的E1之间可以相同或不同,各个寡核苷酸序列的E2之间可以相同或不同;利用TagF和TagR,通过PCR方法,从寡核苷酸池中取出所需寡核苷酸序列组,并将所取出的寡核苷酸序列生成双链DNA;将双链DNA经过E1和E2进行酶切,在所述双链DNA末端形成互补的粘性末端;将切割后的DNA片段进行连接;高通量DNA测序,筛选出正确的DNA序列。本专利技术第三个方面是提供另一种合成DNA的方法,所述合成DNA的方法的步骤包括:提供寡核苷酸,所述寡核苷酸两端分别连接有标签DNA序列,得到寡核苷酸池;其中,所述寡核苷酸序列结构如下:TagF-E1-S-E2-TagR其中,TagF和TagR分别为两端的标签DNA序列,其特异性标记靶标DNA;E1和E2为酶切位点,S为靶标DNA序列;各个寡核苷酸序列中的E1和E2可以相同或不同,各个寡核苷酸序列的E1之间可以相同或不同,各个寡核苷酸序列的E2之间可以相同或不同;通过PCR方法,从寡核苷酸池中取出所需寡核苷酸序列组,并将所取出的寡核苷酸序列生成双链DNA;其中,每组寡核苷酸序列中,有至少两条序列结构如下:TagF-E1x-S-E2x-TagRTagF-E1y-S-E2y-TagR其中,E1x、E2x、E1y、E1y之间可以相同或不同,并且可以与其他寡核苷酸序列的E1和E2相同或不同;并优选为E1x、E2x不同,E1y、E2y不同;更优选为E1x与其他寡核苷酸序列的E1不同,E2y与其他寡核苷酸序列的E2不同;更优选为E1和E2y相同,但是与其他的E1和E2不同;将双链DNA进行E1和E2酶切,在所述双链DNA末端形成互补的粘性末端;并且经过E2x、E1y酶切后,保留TagF-E1x-S和S-E2y-TagR;将切割后的DNA片段进行连接;并通过PCR方法在连接后的DNA片段两端引入一段末端核苷酸序列;高通量DNA测序,筛选出正确的DNA序列。本专利技术第四个方面是提供另一种合成DNA的方法,所述合成DNA的方法的步骤包括:提供寡核苷酸,所述寡核苷酸两端分别连接有标签DNA序列,得到寡核苷酸池;其中,所述寡核苷酸序列结构如下:TagF-E1-S-E2-TagR其中,TagF和TagR分别为两端的标签DNA序列,其特异性标记靶标DNA;E1和E2为酶切位点,S为靶标DNA序列;通过PCR方法,从寡核苷酸池中取出所需寡核苷酸序列组,并将所取出的寡核苷酸序列生成双链DNA;将双链DNA进行E1和E2酶切,在所述双链DNA末端形成互补的粘性末端;将切割后本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种合成DNA的方法,其特征在于,所述合成DNA的方法的步骤包括:提供寡核苷酸池,所述寡核苷酸池中含有至少两种寡核苷酸;采用PCR方法,从寡核苷酸池中取出所需寡核苷酸序列组,并将所取出的寡核苷酸序列生成双链DNA;将双链DNA进行酶切,在所述双链DNA末端形成互补的粘性末端;将切割后的DNA片段进行连接;高通量DNA测序,筛选出正确的DNA序列。
【技术特征摘要】
1.一种合成DNA的方法,其特征在于,所述合成DNA的方法的步骤包括:提供寡核苷酸池,所述寡核苷酸池中含有至少两种寡核苷酸;采用PCR方法,从寡核苷酸池中取出所需寡核苷酸序列组,并将所取出的寡核苷酸序列生成双链DNA;将双链DNA进行酶切,在所述双链DNA末端形成互补的粘性末端;将切割后的DNA片段进行连接;高通量DNA测序,筛选出正确的DNA序列。2.根据权利要求1所述的DNA的方法,其特征在于,所述合成DNA的方法的步骤包括:提供寡核苷酸,所述寡核苷酸两端分别连接有标签DNA序列,得到寡核苷酸池;其中,所述寡核苷酸序列结构如下:TagF-E1-S-E2-TagR其中,TagF和TagR分别为两端的标签DNA序列,其特异性标记靶标DNA;E1和E2为酶切位点,S为靶标DNA序列;利用TagF和TagR,通过PCR方法,从寡核苷酸池中取出所需寡核苷酸序列组,并将所取出的寡核苷酸序列生成双链DNA;将双链DNA进行E1和E2酶切,在所述双链DNA末端形成互补的粘性末端;将切割后的DNA片段进行连接;高通量DNA测序,筛选出正确的DNA序列。3.根据权利要求2所述的DNA的方法,其特征在于,所述合成DNA的方法的步骤包括:提供寡核苷酸,所述寡核苷酸两端分别连接有标签DNA序列,得到寡核苷酸池;其中,所述寡核苷酸序列结构如下:TagF-E1-S-E2-TagR其中,TagF和TagR分别为两端的标签DNA序列,其特异性标记靶标DNA;E1和E2为酶切位点,S为靶标DNA序列;通过PCR方法,从寡核苷酸池中取出所需寡核苷酸序列组,并将所取出的寡核苷酸序列生成双链DNA;其中,每组寡核苷酸序列中,有至少两条序列结构如
\t下:TagF-E1x-S-E2x-TagRTagF-E1y-S-E2y-TagR将双链DNA进行E1和E2酶切,在所述双链DNA末端形成互补的粘性末端;保留TagF-E1x-S和S-E2y-TagR将切割后的DNA片段进行连接;并通过PCR方法在连接后的DNA片段两端引入一段末端核苷酸序列;高通量DNA测序,筛选出正确的DNA序列。4.根据权利要求2所述的DNA的方法,其特征在于,所述合成DNA的方法的步骤包括:提供寡核苷酸,所述寡核苷酸两端分别连接有标签DNA序列,得到寡核苷酸池;其中,所述寡核苷酸序列结构如下:TagF-E1-S-E2-TagR其中,TagF和TagR分别为两端的标签DNA序列,其特异性标记靶标DNA;E1和E2为酶切位点,S为靶标DNA序列;通过PCR方法,从寡核苷酸池中取出所需寡核苷酸序列组,并将所取出的寡核苷酸序列生成双链D...
【专利技术属性】
技术研发人员:王金,赵国屏,
申请(专利权)人:王金,赵国屏,
类型:发明
国别省市:上海;31
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