一种提高原核包涵体表达复性率的复性液及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体为一种提高原核包涵体表达复性率的复性液及其制备方法和应用。本发明专利技术提供了一种优化后的复性液，该复性液可以使粗制品半抑制率比原来提高近一倍，显著提升了科研单位及生产企业的重组蛋白制品的制备效率与利润收益，该复性液的制备方法简单，适合规模化工业生产的需要。通过对HER2阳性乳腺癌靶向药物使用本发明专利技术的复性液及变复性方法进行生产，有效解决了TP25包涵体表达中复性效率低下问题，提高了复性液中活性蛋白的回收率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体为一种提高原核包涵体表达复性率的复性液及其制备方法和应用。
技术介绍
原核表达是一种常用的异源表达方式，利用此表达系统能实现快速、大量、高效获得重组蛋白的目的，而且拥有耗时短、可控性强等优势，所以很多企业都选用此表达系统，但这种表达方式在表达过程中极易形成包涵体，虽然包涵体预示着较大的表达量，但经变复性后的活性回收率大大降低，影响了生产效率与收益，加大了产品的生产成本。我国每年乳腺癌新增病例超二十万，30％为HER2阳性，TP25是针对HER2阳性乳腺癌的新型靶向抗肿瘤药物，它是利用现代基因工程技术手段，通过原核表达方式获得的一类蛋白药物，然而由于其表达过程中极易形成包涵体，活性回收率大大降低，影响了生产效率与收益，加大了产品的生产成本，因此，寻找一种有效的制备HER2阳性乳腺癌靶向药物TP25包涵体的复性液及复性方法，使其既能提高蛋白复性率又能有效降低复性成本，具有非常重要的生产实践意义。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术的目的之一是提供了一种提高原核包涵体表达复性率的复性液。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种制备HER2阳性乳腺癌靶向药物TP25包涵体的复性液，包括以下组份：100mMNa2HPO4；1.4mMGSH；1mMEDTA；0.5M精氨酸；0.5M尿素，所述复性液的pH值为8.5。本专利技术的目的之二是提供了上述提高原核包涵体表达复性率的复性液的制备方法。本专利技术采用如下技术方案：如上所述的一种提高原核包涵体表达复性率的复性液的制备方法，包括以下步骤：精确称取精氨酸、Na2HPO4和EDTA，加入到15℃～30℃的注射用水中搅拌溶解，用冰醋酸调ph至8.5，然后加入尿素搅拌溶解，用15℃～30℃注射用水补足余量,常温下继续搅拌30分钟，然后预冷至7～12℃，使用前一小时在搅拌条件下加入GSH，一直搅拌至使用。本专利技术的目的之三是提供了如上所述的一种提高原核包涵体表达复性率的复性液在HER2阳性乳腺癌靶向药物TP25包涵体变复性中的应用。作为优选，上述应用的具体方法步骤为：(1)菌种活化和发酵培养：进行菌种活化培养，然后进行放大诱导发酵培养，收集发酵液中的菌体细胞，利用超生破碎法获得表达出的包涵体；(2)包涵体变复性：使用lysisbuffer对包涵体进行清洗，以10～14ml/mg的比例向收集到的洁净包涵体中加入预冷至2～8℃的变性液进行变性，充分搅拌后离心收集变性完全的蛋白溶液，在250～300rpm搅拌速度下，以1:70～1:120倍体积比将变性液逐滴加入7～12℃的上述复性液中，将复性液在7～12℃条件下复性14～18小时；(3)蛋白精制：根据工艺要求，进行纯化工艺，最终获得目的蛋白制品。作为优选，步骤(2)中所述变性液与复性液的体积比为1:120。作为优选，步骤(2)中所述变性液包括以下组份：6MGuanidine-Cl,100mM磷缓(pH＝8.0),2mMEDTA,6mMDTT。作为优选，所述步骤(2)中，12000～15000rpm、6～10℃条件下离心15～20分钟收集变性完全的蛋白溶液。作为优选，所述步骤(2)中，复性结束后将复性液在10000～12000rpm、2℃～8℃条件下离心30～45分钟，收集上清液，再进行超滤浓缩后便得到复性后的蛋白溶液。作为优选，所述步骤(1)中进行放大诱导发酵培养时IPTG使用浓度为0.1mM。本专利技术的有益效果为：(1)本专利技术提供了一种优化后的复性液，该复性液可以使粗制品半抑制率比原实验步骤提高近一倍，显著提升了科研单位及生产企业的重组蛋白制品的制备效率与利润收益。该复性液的制备方法简单，适合规模化工业生产的需要。(2)通过对HER2阳性乳腺癌靶向药物使用一种优选的包涵体复性液及变复性方法进行生产，有效解决了TP25包涵体表达中复性效率低下问题，提高了复性液中活性蛋白的回收率。(3)通过实验对比分析，复性方法选用滴加稀释法，使蛋白回收率由74％提高至89％。(4)通过大量实验研究得到，制备HER2阳性乳腺癌靶向药物TP25包涵体的复性方法中，在相同表达时间前提下，IPTG用量为0.1mM时诱导表达的包涵体量比1.0M时要大，所以选定IPTG使用浓度为0.1mM，这使IPTG使用量缩减为原来的10％，表达量比1.0M诱导量提升21％，缩减成本的前提下带来了蛋白表达量的提高，另外用量的减少也降低了最终产品IPTG残留，利于产品质量。附图说明图1：不同处理所得样品SDS-PAGE图。具体实施方式下面结合实施例，对本专利技术的技术方案做进一步具体说明。实施例1一种提高原核包涵体表达复性率的复性液，包括以下组份：100mMNa2HPO4；1.4mMGSH；1mMEDTA；0.5M精氨酸；0.5M尿素，所述复性液的pH值为8.5。所述的提高原核包涵体表达复性率的复性液是由以下方法制得的：精确称取87.1克L-精氨酸；35.814克Na2HPO4；0.29224克EDTA，用700ml、15℃注射用水中进行搅拌溶解，冰醋酸调pH至8.5，加入30.03克尿素溶解后用15℃注射用水补至1000ml,常温下继续搅拌30分钟，然后预冷至12℃，使用前一小时在搅拌条件下加入430毫克GSH(还原性谷胱甘肽)，一直搅拌至使用。实施例2：使用不同复性液所得粗制品的半抑制浓度对比设置不同配方复性液组，其缓冲体系都为PH＝9.5的100mM磷酸盐缓冲液，并测定使用对应复性液所得粗制品半抑制浓度(IC50)，复性液组成如下所示，所测IC50结果如表1所示。Buffer1:1mMGSH&0.4mMGSSG；2％(v/v)甘油；0.1M尿素；0.1MNaCl；0.1M精氨酸；1mMEDTA。Buffer2:1mMGSH&0.4mMGSSG；2％(v/v)甘油；0.1M尿素；0.1MNaCl；0.3M精氨酸；1mMEDTA。Buffer3:1mMGSH&0.4mMGSSG；2％(v/v)甘油；0.1M尿素；0.1MNaCl；0.5M精氨酸；1mMEDTA。Buffer4:1.4mMGSH；2％(v/v)甘油；0.1M尿素；0.1MNaCl；0.1M精氨酸；1mMEDTA。Buffer5:1.4mMGSH；2％(v/v)甘油；0.1M尿素；0.1MNaCl；0.3M精氨酸；1mMEDTA。Buffer6:1.4mMGSH；2％(v/v)甘油；0.1M尿素；0.1MNaCl；0.5M精氨酸；1mMEDTA。Buffer7:1.4mMGSH；0.5M尿素；0.5M精氨酸；1mMEDTA。Buffer8:1.4mMGSH；0.5M精氨酸；1mMEDTA。表2.使用不同复性液所得粗制品半抑制浓度由表1中数据可知，使用Buffer7复性液所得粗制品的IC50最低，因此选定其为最终使用复性液。选定复性液组成成分后，进行了复性液PH的确定，选择8.5与9.5两组，复性液组成如下所示，IC50结果如表2所示。Buffer1(PH＝9.5):1.4mMGSH；1mMEDTA；0.5M精氨酸；0.5M尿素。Buffer2(PH＝9.5):1.8mMGSH；1mMEDTA；0.5M精氨酸。Buffer3(PH＝8.5):本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高原核包涵体表达复性率的复性液，其特征在于包括以下组份：100mM Na2HPO4；1.4mM GSH；1mM EDTA；0.5M 精氨酸；0.5M 尿素，所述复性液的pH值为8.5。

【技术特征摘要】
1.一种提高原核包涵体表达复性率的复性液，其特征在于包括以下组份：100mMNa2HPO4；1.4mMGSH；1mMEDTA；0.5M精氨酸；0.5M尿素，所述复性液的pH值为8.5。2.如权利要求1所述的一种提高原核包涵体表达复性率的复性液的制备方法，其特征在于包括以下步骤：精确称取精氨酸、Na2HPO4和EDTA，加入到15℃~30℃的注射用水中搅拌溶解，用冰醋酸调ph至8.5，然后加入尿素搅拌溶解，用15℃~30℃注射用水补足余量,常温下继续搅拌30分钟，然后预冷至7~12℃，使用前一小时在搅拌条件下加入GSH，一直搅拌至使用。3.如权利要求1所述的一种提高原核包涵体表达复性率的复性液在HER2阳性乳腺癌靶向药物TP25包涵体变复性中的应用。4.如权利要求3所述的应用，具体方法步骤为：菌种活化和发酵培养：进行菌种活化培养，然后进行放大诱导发酵培养，收集发酵液中的菌体细胞，利用超生破碎法获得表达出的包涵体；包涵体变复性：使用lysisbuffer对包涵体进行清洗，以10~14ml/mg的比例向收集到的洁净包涵体中加入预冷至2~8℃的变性液进...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹强庚，庞广礼，彭延杰，林童俊，李锋，梁邦领，
申请(专利权)人：山东省生物制品研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37