产α-熊果苷的基因工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了产α-熊果苷的基因工程菌及其构建方法和应用。本发明专利技术提供了重组菌，为将淀粉蔗糖酶编码基因导入目的菌中，得到重组菌；所述淀粉蔗糖酶来源于野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术将来源于野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris CGMCC 1.3408的淀粉蔗糖酶基因导入大肠杆菌中，构建基因工程菌，用其来生产α-熊果苷，转化效率达到99％,生产强度为7.56g/L/h，是目前为止国内外报道的最高水平，同时在生产过程中不用相对较贵的麦芽糖的作为供体，无需纯化酶。这样将大大降低α-熊果苷的生产成本，因此这一菌株将会在α-熊果苷的生产中占有重要地位。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，具体涉及到产α-熊果苷的基因工程菌及其构建方法和应用。
技术介绍
熊果苷属氢醌苷类化合物，化学名为4-羟基苯基-D-吡喃葡萄糖苷，存在于熊果、越橘等植物中是一种高效的美白活性物质。熊果苷具有显著的抑制酪氨酸酶活性，从而阻断多巴及多巴醌的合成，抑制黑色素的合成，达到美白的功效。熊果苷有两种同分异构体，α-熊果苷和β-熊果苷。2003年，Kazuhisa等人已经发现α-熊果苷的增白效果是β-熊果苷的10倍以上。α-熊果苷的IC50为2.1mM,β-熊果苷的IC50为30mM。同时α-熊果苷的生物安全性更好，α-熊果苷不会抑制黑色素细胞的生长，生物副作用小，而β-熊果苷会抑制细胞的生长。因此α-熊果苷在化妆品上的应用更广泛，将会取代β-熊果苷。2000年以来，许多国际知名的化妆品牌，如日本知名品牌DHC、资生堂等都开始使用α-熊果苷作为美白产品的增白剂。但是目前由于生产成本较高，只有高档的化妆品才能使用。因此开发高效、低成本的生产方法将会促进α-熊果苷的大规模应用。目前合成熊果苷的方法主要有四种，有机合成法、植物提取法、生物转化法和酶合成法。有机合成法和植物提取法主要用于生产β-熊果苷，而α-熊果苷目前获取的主要途径是酶合成法和生物转化法。利用一分子的葡萄糖和一分子的氢醌结合形成单一的α-熊果苷。酶合成法，目前合成α-熊果苷所用的酶主要包括，蔗糖磷酸酶(Sucrosephospholylase)，葡聚糖蔗糖酶(Dextransucrase)，α-葡萄糖苷酶(a-Glucosidase)，淀粉蔗糖酶(Amylosucrase)以及脂肪酶。利用上述的其中一种酶以蔗糖或者麦芽糖为供体，以氢醌为受体，合成α-熊果苷。目前应用较多的是糖苷酶被运用于合成α-熊果苷。1995年日本的shegetakaokada小组利用糖苷酶合成了α-熊果苷。2011年北京化工大学，邓莉采用脂肪酶在有机相中合成α-熊果苷，最高转化率为95％，转化时间在10个小时以上，并申请了专利，专利号为CN102517361A，但是所采用的转化液的溶剂为有毒的有机溶剂。2011年Dong-HoSeo等采用来源于耐辐射地热菌(Deinococcusgeothermalis)的淀粉蔗糖酶，可以在24h内转化2.3mM对苯二酚，转化率可以达到90％。但是采用酶法合成熊果苷，酶本身需要纯化，而且由于氢醌有一定的毒性，会导致酶的活性大幅度降低，从而导致产率降低。因此酶法合成α-熊果苷也有一定的局限性。生物转化法主要是利用生物体中的酶对外源化合物进行酶催化反应，这些生物体主要包括植物细胞、微生物细胞。植物细胞，2006年张章利用培养20d的西洋参冠瘿组织培养液，加入60mg/ml的对苯二酚，培养60h后成功得到了熊果苷。2007年严春艳等利用何首乌毛状根器转化合成了熊果苷，当底物浓度为1100mg/L，培养72h后熊果苷的转化率可达81.45％。但是采用植物的组织培养物转化时，植物的组织培养时间很长，导致生产效率很低，成本较高。微生物细胞，主要是利用这些微生物能够表达合成α-熊果苷相应的酶。前人的研究表明多种微生物可以合成α-熊果苷，如巨大芽孢杆菌CNIB-8508、酿酒酵母、丝状真菌。其中芽孢杆菌代谢的蔗糖磷酸化酶催化合成了α-熊果苷。以湿菌体50mg/mL，破碎细胞粗酶液催化合成α-熊果苷,反应时间为24h，经过反应条件的优化后,α-熊果苷含量达到0.35mg/mL、对苯二酚转化率为74％。2012年，朱松洁等对22种微生物物种，包括丝状真菌酵母菌以及细菌等不同微生物发酵生产熊果苷的能力进行筛选，并用高效液相色谱法对发酵生产的熊果苷进行定量比较，结果表明：米根霉、白地霉、酵母910、酵母904以及枯草芽孢杆菌可以利用对苯二酚发酵生产熊果苷，其中以米根霉的产量最高，产量达到441.30mg/L。北京化工大学邓莉等对利用嗜麦芽黄单胞菌BT-112来生产α-熊果苷进行了深入的研究。2007年王秀棒采用生物发酵嗜麦芽黄单胞菌BT-112来生产α-熊果苷，最佳反应条件为：反应温度为35℃，对苯二酚浓度为48mmol·L-1，蔗糖与对苯二酚的摩尔比为2：1，反应时间为48h，反应转速为180r·min-1，最高反应转化率为91.2％。2008年，张鹏等利用添加表面活性剂Tween80，通过发酵36h，对苯二酚浓度为60mmol·L-1。转化率可以达到96.2％。2014年邓莉等通过流加对苯二酚，可以使α-熊果苷的产量达到61.7g/L，转化率为94.5％,发酵时间为72h，这是目前报道的最高水平。生物细胞转化法是高效的α-熊果苷生产方法，但是由于采用野生型的微生物细胞，合成α-熊果苷的酶的表达水平较低。同时野生型菌株的生物量也有限，因此构建基因工程菌来生产α-熊果苷是研究的方向，2006年台湾的Wen-TengWu等在大肠杆菌中表达来源于黄单胞菌(Xanthomonascampestris)的糖苷转移酶(Transglucosidase)利用麦芽糖和对苯二酚，在1小时内可以生产23g/L的熊果苷，转化率为83％。但是所用的供体为麦芽糖，成本较高，同时转化率也只有83％，因此迫切需要构建高效率、安全、低成本的α-熊果苷基因工程菌株，以满足工业化生产α-熊果苷的需求。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供重组菌。本专利技术提供的重组菌，为将淀粉蔗糖酶编码基因导入目的菌中，得到重组菌；所述淀粉蔗糖酶来源于野油菜黄单胞菌Xanthomonascampestris。上述重组菌中，所述野油菜黄单胞菌Xanthomonascampestris为野油菜黄单胞菌XanthomonascampestrisCGMCC1.3408。上述重组菌中，所述淀粉蔗糖酶的氨基酸序列为序列表中序列2。上述重组菌中，所述淀粉蔗糖酶编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1。上述重组菌中，所述淀粉蔗糖酶编码基因通过重组载体导入目的菌；所述重组载体为将所述淀粉蔗糖酶编码基因插入表达载体得到的重组载体，本实施例中的重组载体为将序列表中序列1所示的淀粉蔗糖酶基因替换pET28a载体NheI和XhoI酶切位点间的DNA片段得到的重组载体，将该重组载体命名为pET28a-XcAS，编码淀粉蔗糖酶的氨基酸序列为序列2。上述重组菌中，所述目的菌为大肠杆菌。本专利技术的另一个目的是提供一种重组载体。本专利技术提供的重组载体，将所述淀粉蔗糖酶编码基因插入表达载体得到的重组载体；所述淀粉蔗糖酶的氨基酸序列为序列表中序列2；所述淀粉蔗糖酶编码基因的核苷酸序列具体为序列表中序列1。所述重组载体为将所述淀粉蔗糖酶编码基因插入表达载体得到的重组载体，本实施例中的重组载体为将序列表中序列1所示的淀粉蔗糖酶基因替换pET28a载体NheI和XhoI酶切位点间的DNA片段得到的重组载体，将该重组载体命名为pET28a-XcAS，编码淀粉蔗糖酶的氨基酸序列为序列2。上述的重组菌或上述的重组载体或上述淀粉蔗糖酶或其编码基因在制备α-熊果苷中的应用也是本专利技术保护的范围。本专利技术的第三个目的是提供一种制备α-熊果苷的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：1)IPTG诱导培养上述的重组菌，收集培养产物的沉本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组菌，为将淀粉蔗糖酶编码基因导入目的菌中，得到重组菌；所述淀粉蔗糖酶来源于野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris。

【技术特征摘要】
1.重组菌，为将淀粉蔗糖酶编码基因导入目的菌中，得到重组菌；所述淀粉蔗糖酶来源于野油菜黄单胞菌Xanthomonascampestris。2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述野油菜黄单胞菌Xanthomonascampestris为野油菜黄单胞菌XanthomonascampestrisCGMCC1.3408。3.根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于：所述淀粉蔗糖酶的氨基酸序列为序列表中序列2。4.根据权利要求1-3中任一所述的重组菌，其特征在于：所述淀粉蔗糖酶编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1。5.根据权利要求1-4中任一所述的重组菌，其特征在于：所述淀粉蔗糖酶编码基因通过重组载体导入目的菌；所述重组载体为将所述淀粉蔗糖酶编码基因插入表达载体得到的重组载体。...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡美荣，彭颖，陶勇，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11