一种α‑酮基丁酸的发酵生产工艺制造技术

本发明专利技术涉及一种α‑酮基丁酸的发酵生产工艺，利用热诱导型表达载体过表达经过定点突变的苏氨酸脱水酶编码基因ilvA并敲除乙酰羟基酸合成酶III的大亚基编码基因ilvI；所用菌株是以苏氨酸生产菌株E.coliTHRD为出发菌株；该生产工艺可以有效解决发酵过程中α‑酮基丁酸对菌体生长和产酸的抑制问题，发酵28h后α‑酮基丁酸最高产量可以达到22.8g/L。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及化合物生物技术生产领域，尤其是一种α-酮基丁酸的发酵生产工艺。
技术介绍
α-酮基丁酸的生产方法包括化学合成法和生物合成法。化学法是由草酸二乙酯和丙酸乙酯混合水解得到α-酮基丁酸。生物法合成α-酮基丁酸主要为前体物转化法和直接发酵法。Nakahara等(1994)以1，2-丁二醇为碳源和底物，采用马红球菌(Rhodococcusequi)IF03730将其转化为α-酮基丁酸，培养32h转化率为68.2％。随后研究发现恶臭假单胞菌(Pseudomonassputita)和施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)SDM分别能将巴豆酸和DL-2-羟基丁酸转化为α-酮基丁酸，其产量为4.8g/L。马翠卿等(ZL201110376233.8)报道了以L-苏氨酸为底物利用含L-苏氨酸脱水酶的假单胞菌、棒杆菌属或芽孢杆菌属为生物催化剂制备α-酮基丁酸的方法，转化液中α-酮基丁酸的浓度为25.6g/L，转化率为99.6％。陈宁等(201410132996.1)构建了过表达的苏氨酸脱水酶编码基因ilvA、敲除乙酰羟基酸合成酶Ⅰ大亚基编码基因ilvB、乙酰羟基酸合成酶Ⅲ大亚基编码基因ilvI以及苏氨酸操纵子前导肽编码基因thrL的基因工程大肠杆菌，该菌株以葡萄糖为底物发酵20-24h后，α-酮基丁酸最高产量达到15.7g/L。该方法通过低拷贝质粒pwsk29直接过表达苏氨酸脱水酶编码基因ilvA，且出发菌株为大肠杆菌E.coliMG1655标准株。目前工业生产α-酮基丁酸主要采用化学合成法，但该方法存在反应条件复杂、能耗大、污染重等问题。而生物法的前体物转化法存在着底物生产成本高，微生物制剂难于培养等问题；生物法中利用重组大肠杆菌直接发酵生产α-酮基丁酸最大的问题在于产物毒性高，如图1所示，α-酮基丁酸浓度达到8g/L以上时，α-酮基丁酸对大肠杆菌菌体生长和产物合成存在严重的抑制作用。同时通过实验发现，敲除乙酰羟基酸合成酶Ⅰ基因ilvBN会影响缬氨酸的合成，菌体生物量大幅度下降，且对提升α-酮基丁酸的积累量无明显作用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种α-酮基丁酸的发酵生产工艺，可高效制备α-酮基丁酸。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：一种α-酮基丁酸的发酵生产工艺，对大肠杆菌E.coliTHRD(保藏号CGMCCNo.11074)苏氨酸脱水酶编码基因ilvA进行定点突变、解除L-异亮氨酸对ilvA的反馈抑制的基础上过表达ilvA；敲除了乙酰羟基酸合成酶III的大亚基编码基因ilvI；利用温度控制诱导的方式，采用发酵法生产α-酮丁酸，其中，最佳诱导时机和最合适的升温诱导模式为：35-37℃培养菌体，生长到OD600为10-15时，1h内升温至40-42℃(快速升温)。优选的，上述α-酮基丁酸的发酵生产工艺，利用温控诱导方式制备α-酮基丁酸，具体步骤如下：Ⅰ、摇瓶发酵积累α-酮基丁酸<1>活化斜面培养：将产生α-酮基丁酸的基因工程菌划线接于1支新鲜AmpR抗性斜面，37℃培养15-17h；<2>摇瓶种子培养：从新鲜活化斜面上挑取1环菌体接于30mL的种子培养基中，200r/min，35-37℃恒温振荡培养，种子培养期间根据指示剂苯酚红颜色变化，用25％(W/V)氨水调节pH≈6.7-7.0；<3>摇瓶发酵培养：保证溶氧充足情况下，500mL挡板三角瓶装液量30mL，9层纱布封口；待种子液培养至OD600值约为8-10时，种龄为10-12h，按8-10％接种量接入发酵培养基中，200r/min，32-35℃恒温振荡培养；待发酵4-6h，菌体OD600值约为10-15时，将发酵温度从32-35℃直接提高到40-42℃开始升温诱导，直至24h发酵结束，发酵期间补加25％(W/V)的氨水维持发酵液pH≈6.7-7.0；上述步骤(3)所得α-酮基丁酸的产量可达到9.4-12.5g/L；或Ⅱ、7.5L发酵罐发酵积累α-酮基丁酸<1>活化斜面培养：将产生α-酮基丁酸的基因工程菌划线接于4支新鲜AmpR抗性斜面，37℃培养16h左右；<2>7.5L罐种子培养：吸取适量灭菌的去离子水于4支新鲜的活化斜面，刮下所有菌体后将菌悬液接入装有2L种子培养基的5L发酵罐；种子培养温度为35-37℃，通气量变化范围为2-5L/min，搅拌转速变化范围为100-500r/min，期间通过流加25％(W/V)的氨水控制pH≈6.7-7.0；<3>7.5L罐发酵培养：种子液培养至OD600＝10-15时，种龄约为7h，将500mL左右种子液转移到含有3.5L新鲜无菌发酵培养基的7.5L发酵罐中，总装液量为4L，接种量为8-10％；32-35℃开始进行发酵培养；待发酵液OD600值为20-25时，在0.5-1.0h内将发酵温度从32-35℃提高到40-42℃开始升温诱导，直至28h发酵结束，发酵过程中通过自动流加25％(W/V)氨水控制pH≈6.7-7.0，溶氧控制在30-50％，通气量变化范围为2-8L/min，搅拌转速变化范围为200-900r/min；当发酵培养基中葡萄糖耗完后，将80％(W/V)葡萄糖溶液按1-1.5mL/min的脉冲速度流加至培养基中以维持发酵液中残糖浓度控制在0-1g/L；上述步骤(3)所得α-酮基丁酸的产量可达到16.5-22.8g/L。上述α-酮基丁酸的制备方法，所得发酵液中α-酮基丁酸的检测方法为：发酵液样品经13000转离心2min，上清液经0.22μm膜过滤后用UltiMate3000(ThermoScientific)高效液相测试α-酮丁酸产量，检测条件各参数为：色谱柱aminexRHPX-87H(300mm×7.8mm)，流动相为5mmol/LH2SO4，流速0.5mL/min，柱温30℃，检测波长215nm，进样量为20μL。优选的，上述α-酮基丁酸的发酵生产工艺，所述产生α-酮基丁酸的基因工程菌是以苏氨酸生产菌株E.coliTHRD(保藏号CGMCCNo.11074)为出发菌株，利用热诱导型表达载体PBV220、PBV221或PBV222过表达定点突变的苏氨酸脱水酶编码基因ilvA并敲除乙酰羟基酸合成酶III的大亚基编码基因ilvI。优选的，上述α-酮基丁酸的发酵生产工艺，所述定点突变的苏氨酸脱水酶编码基因ilvA的核苷酸序列为序列表<400>2所示序列。所述编码基因ilvA原始(未突变)核苷酸序列为序列表<400>1所示序列；所述编码基因ilvI的核苷酸序列为序列表<400>3所示序列；优选的，上述α-酮基丁酸的发酵生产工艺，所述产生α-酮基丁酸的基因工程菌是由下述方法构建得到的，具体步骤为：一、基因ilvI的敲除<1>采用PCR技术以大肠杆菌E.coliTHRD(保藏号CGMCCNo.11074)基因组为模板，根据E.coliMG1655中ilvI(GeneID:948793)基因的5’和3’端500bp序列设计同源臂引物，扩增获取ilvI基因的上下游同源臂；<2>采用PCR技术以本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种α‑酮基丁酸的发酵生产工艺，其特征在于：对大肠杆菌E.coliTHRD(保藏号CGMCC No.11074)苏氨酸脱水酶编码基因ilvA进行定点突变、解除L‑异亮氨酸对ilvA的反馈抑制的基础上过表达ilvA；敲除了乙酰羟基酸合成酶III的大亚基编码基因ilvI；利用温度控制诱导的方式，采用发酵法生产α‑酮基丁酸，其中，最佳诱导时机和最合适的升温诱导模式为：35‑37℃培养菌体，生长到OD600为20‑25时，0.5h内升温至40‑42℃。

【技术特征摘要】
1.一种α-酮基丁酸的发酵生产工艺，其特征在于：对大肠杆菌E.coliTHRD(保藏号CGMCCNo.11074)苏氨酸脱水酶编码基因ilvA进行定点突变、解除L-异亮氨酸对ilvA的反馈抑制的基础上过表达ilvA；敲除了乙酰羟基酸合成酶III的大亚基编码基因ilvI；利用温度控制诱导的方式，采用发酵法生产α-酮基丁酸，其中，最佳诱导时机和最合适的升温诱导模式为：35-37℃培养菌体，生长到OD600为20-25时，0.5h内升温至40-42℃。2.根据权利要求1所述的α-酮基丁酸的发酵生产工艺，其特征在于：利用温控诱导方式制备α-酮基丁酸，具体步骤如下：Ⅰ、摇瓶发酵积累α-酮基丁酸<1>活化斜面培养：将产生α-酮基丁酸的基因工程菌划线接于1支新鲜AmpR抗性斜面，37℃培养16h左右；<2>摇瓶种子培养：从新鲜活化斜面上挑取1环菌体接于30mL的种子培养基中，200r/min，35-37℃恒温振荡培养，种子培养期间根据指示剂苯酚红颜色变化，用25％(W/V)氨水调节pH≈6.7-7.0；<3>摇瓶发酵培养：保证溶氧充足情况下，500mL挡板三角瓶装液量30mL，9层纱布封口；待种子液培养至OD600值约为8-10时，种龄为10-12h，按8-10％接种量接入发酵培养基中，200r/min，32-35℃恒温振荡培养；待发酵4-6h，菌体OD600值约为10-15时，将发酵温度从32-35℃直接提高到40-42℃开始升温诱导，直至24h发酵结束，发酵期间补加25％(W/V)的氨水维持发酵液pH≈6.7-7.0；上述步骤(3)所得α-酮基丁酸的产量可达到9.4-12.5g/L；或Ⅱ、7.5L发酵罐发酵积累α-酮基丁酸<1>活化斜面培养：将产生α-酮基丁酸的基因工程菌划线接于4支新鲜AmpR抗性斜面，37℃培养16h左右；<2>7.5L罐种子培养：吸取适量灭菌的去离子水于4支新鲜的活化斜面，刮下所有菌体后将菌悬液接入装有2L种子培养基的5L发酵罐；种子培养温度为35-37℃，通气量变化范围为2-5L/min，搅拌转速变化范围为100-500r/min，期间通过流加25％(W/V)的氨水控制pH≈6.7-7.0；<3>7.5L罐发酵培养：种子液培养至OD600＝10-15时，种龄约为7h，将500mL左右种子液转移到含有3.5L新鲜无菌发酵培养基的7.5L发酵罐中，总装液量为4L，接种量为8-10％；32-35℃开始进行发酵培养；待种子液OD600值为20-25时，在0.5-1.0h内将发酵温度从32-35℃提高到40-42℃开始升温诱导，直至28h发酵结束，发酵过程中通过自动流加25％(W/V)氨水控制pH≈6.7-7.0，溶氧控制在30-50％，通气量变化范围为2-8L/min，搅拌转速变化范围为200-900r/min；当发酵培养基中葡萄糖耗完后，将80％(W/V)葡萄糖溶液按1-1.5mL/min的脉冲速度流加至培养基中以维持发酵液中残糖浓度控制在0-1g/L；上述步骤(3)所得α-酮基丁酸的产量可达到16.5-22.8g/...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢希贤，陈宁，齐俊生，范晓光，徐庆阳，张成林，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12