一种高灵敏度反向斑点杂交方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种高灵敏度反向斑点杂交方法，该方法通过在金属膜表面上实现核酸杂交过程与碱性磷酸酶联过程合二为一进行，从而可以在金属膜表面直接形成碱性磷酸酶标记核酸杂交体的偶联物。本发明专利技术通过一步反应后的显色反应，根据着色的深浅以及杂交信号与金属膜的强烈色差，可以用肉眼快速判断核酸杂交的结果，极大提高了反向斑点杂交的检测灵敏度与分辨能力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种反向斑点杂交方法，特别涉及一种高灵敏度反向斑点杂交方法。
技术介绍
斑点杂交方法首先由Kafato等发展起来，用于在固相支持物上固定几种核酸样品，然后用合适的探针与已固定的样品杂交，并由此判断靶序列的浓度。通过估计样品点发射出的信号强度，与已知浓度的标准品信号强度进行比较，该方法还可以进一步确定待测样品中靶序列的量。应用斑点杂交方法检测序列变异时，若靶序列内存在突变，则其扩增产物在严格的条件下无法与探针杂交，无杂交信号就表示目的基因存在突变。多年来，斑点杂交并未受到研究者的青睐，原因之一在于同一张膜上同样的样品杂交信号有时不稳定。此外，正向杂交须先将PCR扩增产物固定，再与探针进行杂交，这样就要对每个标本的扩增产物进行固定，增加了操作步骤。反向斑点杂交则是由Saiki等提出的一种斑点杂交技术，该技术采用固化了多种特异性探针的固相支持物与扩增靶序列杂交，使一次杂交即可同时筛查被检DNA中的多种突变。这种以固相支持物上固定探针取代固定靶核酸的方式，改变了传统斑点杂交法一次只能检测一种突变的模式，具有快速、简便、重复性好以及信号稳定的特点，尤其在基因突变检测、基因分型、病原体的检测等领域有其独特的优势。现有的反向斑点杂交技术都是以硝酸纤维素膜或尼龙膜作为固相支持物，不仅易于破碎，涉及的反应溶液和反应步骤众多，效率较低，而且检测待测样品中靶序列的灵敏度不高，分辨能力较差，容易出现假阳性和假阴性，难以满足医院临床检测的需求。出于这种考虑，本专利技术的专利技术人进行了研究，目的是解决相关领域现有技术所暴露出来的问题，期望提供一种特异性高、耗时短、易操作的高灵敏度反向斑点杂交方法及其在检测K-ras基因突变中的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种反向斑点杂交方法。该方法通过在金属膜表面上实现核酸杂交过程与碱性磷酸酶联过程合二为一进行，从而可以在金属膜表面直接形成碱性磷酸酶标记核酸杂交体的偶联物。本专利技术通过一步反应后的显色反应，根据着色的深浅以及杂交信号与金属膜的强烈色差，可以用肉眼快速判断核酸杂交的结果，极大提高了反向斑点杂交的检测灵敏度与分辨能力。本专利技术的又一目的在于提供所述方法在检测K-ras基因突变中的应用。根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种高灵敏度反向斑点杂交方法，其包括如下步骤：A)将至少一种核酸探针固定在固相支持物负载的金属膜表面；B)利用预处理液对所述金属膜表面进行预处理；C)将所述核酸探针在包含碱性磷酸酶标记链霉亲和素的杂交液中与生物素标记的靶核酸进行一步反应；D)步骤C)中反应完成后，利用后处理液对所述金属膜表面进行后处理；E)将包含底物的显色溶液与金属膜表面接触进行显色反应。本专利技术的方法在核酸探针与靶核酸杂交的过程中同步实现了碱性磷酸酶标记链霉亲和素与生物素的结合过程，从而可以在金属膜表面直接形成碱性磷酸酶标记核酸杂交体的偶联物，不仅省去了传统反向斑点杂交方法中在杂交反应后需要单独进行酶联反应的步骤，缩短了传统反向斑点杂交方法操作的耗时，而且促进了核酸杂交，提高了碱性磷酸酶标记效率，使得金属膜表面单位面积上覆盖的碱性磷酸酶标记核酸杂交体的偶联物的数量大大增加，再通过显色反应，根据着色的深浅以及杂交信号与金属膜的强烈色差，可以用肉眼快速判断核酸杂交的结果，在同等条件下明显提高了传统核酸反向斑点杂交方法的检测灵敏度与分辨能力。根据本专利技术的一个具体实施例，所述金属膜选自金膜、银膜、铜膜和铝膜，优选银膜和铝膜，所述金属膜的厚度为10nm～100nm。金属是一种具有光泽的物质，其对可见光强烈反射。由于碱性磷酸酶催化底物可产生化学显色反应，能够在金属膜表面产生颜色变化，从而可以通过肉眼直观、快速地观察金属膜表面核酸杂交反应前后斑点颜色的深浅，以准确判断样品中含有的靶核酸情况。作为本专利技术的一个优选实施例，所述的金属膜优选银膜或铝膜。纳米级的银膜或铝膜能够呈现较好的反光性能，可以明显提高显色反应后检测靶核酸的分辨能力。此外，金属膜还结实耐用，易于清洗，容易去除杂交背景。根据本专利技术的一个具体实施例，所述固相支持物选自硝酸纤维素膜、尼龙膜、硅片、载玻片或塑料片，优选塑料片，更优选环烯烃共聚物塑料片。环烯烃共聚物是一种由环烯烃与α-烯烃聚合而成的高附加值热塑性工程塑料，具有很高的透明度。本专利技术的专利技术人经过大量实验与创造性劳动发现，环烯烃共聚物塑料表面能够很好地与金属膜结合，不仅金属膜不容易从塑料表面脱落，而且反光性能非常好，在其表面负载一层纳米厚度的金属膜后，碱性磷酸酶催化底物的显色反应效果更为明显，可以进一步提高本专利技术中的方法检测靶核酸的灵敏度与分辨能力。根据本专利技术的一个优选实施例，负载有金属膜的固相支持物在使用前被真空封装。在本专利技术的方法中，金属膜负载到固相支持物表面的方法以及核酸探针在金属膜表面的固定方法均在本领域技术人员的知识范围内。作为一个优选的实施例，金属膜可以通过真空镀膜的方法蒸镀到固相支持物表面，核酸探针可以通过末端连接的巯基基团与金属膜实现固定连接。在本专利技术的方法中，所述碱性磷酸酶是一种同源二聚体蛋白，是一种含锌的金属酶。每分子酶至少含2个Zn原子。酶上包含3种类型的金属结合位点，即所谓的催化结合位点、结构结合位点和调节结合位点。其中两个催化结合位点的结合则只会导致一个亚单位的磷酸化，即负协作亚单位之间发生相互作用。在本专利技术的方法中，所述生物素有两个环状结构I和II。其中，I环为咪唑酮环，是其与链霉亲和素结合的主要部位；II环为噻吩环，C2上有一戊酸侧链；生物素分子通过其末端的羧基与本专利技术所述的靶核酸连接，从而标记在靶核酸分子上。在本专利技术的方法中，所述链霉亲和素是由链霉菌分泌的一种蛋白质，其分子由4条相同的肽链组成，每条肽链都能结合一个生物素，因此每个链霉亲和素分子能结合4个生物素分子。此外，每条肽链的氨基酸组成中，甘氨酸和丙氨酸的含量较大，肽链中的色氨酸残基是连接生物素的活性基团。所述链霉亲和素与生物素二者亲和结合的常数(K)为1015L/mol。在本专利技术的方法中，靶核酸与核酸探针杂交的同时，链霉亲和素与生物素也进行亲和结合，因此杂交液中的碱性磷酸酶标记链霉亲和素分子与固定在固相支持物表面的核酸探针分子在一步反应中竞争性结合生物素标记的靶核酸分子。本专利技术的专利技术人经过大量实验与创造性劳动发现，本专利技术的方法将所述碱性磷酸酶标记链霉亲和素直接加入到杂交液中，一方面能够使得碱性磷酸酶标记链霉亲和素与生物素标记靶核酸充分的结合；另一方面还能够促进核酸杂交效率，缩短核酸杂交反应的时间。根据本专利技术的一个具体实施例，步骤C)中所述碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂交液中的浓度为0.05～2μg/ml，优选0.1～1.5μg/ml，更优选0.5～1.2μg/ml。在本专利技术的方法中，可以列举的所述碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂交液中的浓度包括但不限于：0.05μg/ml、0.06μg/ml、0.07μg/ml、0.08μg/ml、0.09μg/ml、0.1μg本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高灵敏度反向斑点杂交方法，其包括如下步骤：A)将至少一种核酸探针固定在固相支持物负载的金属膜表面；B)利用预处理液对所述金属膜表面进行预处理；C)将所述核酸探针在包含碱性磷酸酶标记链霉亲和素的杂交液中与生物素标记的靶核酸进行一步反应；D)步骤C)中反应完成后，利用后处理液对所述金属膜表面进行后处理；E)将包含底物的显色溶液与金属膜表面接触进行显色反应。

【技术特征摘要】
1.一种高灵敏度反向斑点杂交方法，其包括如下步骤：
A)将至少一种核酸探针固定在固相支持物负载的金属膜表面；
B)利用预处理液对所述金属膜表面进行预处理；
C)将所述核酸探针在包含碱性磷酸酶标记链霉亲和素的杂交液中与生物素标记的靶核
酸进行一步反应；
D)步骤C)中反应完成后，利用后处理液对所述金属膜表面进行后处理；
E)将包含底物的显色溶液与金属膜表面接触进行显色反应。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述金属膜选自金膜、银膜、铜膜和铝膜，
优选银膜和铝膜，所述金属膜的厚度为10nm～100nm。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤B)中所述预处理液包括胱胺、
脂肪醇聚氧乙烯醚和异构醇；其中，所述脂肪醇聚氧乙烯醚选自C17～C19的脂肪醇聚氧乙烯醚，
所述异构醇选自C10～C13异构醇。
4.根据权利要求1～3中任意一项所述的方法，其特征在于，在所述预处理液中，胱胺为
3～20重量份，脂肪醇聚氧乙烯醚为2～18重量份以及异构醇为0.2～9重量份；优选地，胱胺
为5～10重量份，脂肪醇聚氧乙烯醚为3～12重量份以及异构醇为2～8重量份。
5.根据权利要求1～4中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤C)中所述碱性磷酸酶
标记链霉亲和素在杂交液中的浓度为0.05～2μg/ml，优选0.1～1.5μg/ml，更优选0.5～1.2μg/ml。
6.根据权利要求1～5中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤C)中所述杂交液包括
锌离子、镁离子、表面活性剂和阳离子型聚合物；其中，所述表面活性剂选自吐温和曲拉通，
所述阳离子型聚合物选自阳离子聚丙烯酰胺、多聚赖氨酸和聚合氯化铝。
7.根据权利要求1～6中任意一项所述的方法，其特征在于，在所述杂交液中，锌离子为
0.001～0.1mol/L，镁离子为0.001～0.1mol/L，表面活性剂占杂交液的0.01～2％(v/v)，阳离子
型...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨华卫，曾冀，
申请(专利权)人：北京百诺奇生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11