一种沙门氏菌的检测试纸及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种沙门氏菌的检测试纸及其制备方法，具体提供了一种沙门氏菌的检测试纸，其包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向，所述底板上依次组装有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中，所述胶体金垫上含有胶体金标记的沙门氏菌抗体，所述硝酸纤维素膜上进一步形成有检测线和对照线，所述检测线由能与沙门氏菌结合的沙门氏菌抗体划膜制成，所述对照线由能与沙门氏菌抗体结合的羊抗兔抗体划膜制成。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及检测方法，具体涉及门氏菌的检测试纸及其制备方法。
技术介绍
沙门氏菌是一种常见的人畜共患肠道病原菌，不仅能引起畜禽伤寒、副伤寒等疾病,还能造成人类腹泻、细菌性食物中毒等常见病，威胁人类健康。已知的沙门氏菌血清型有2000余种，广泛分布在自然界中。与人类疾病有关的血清型主要集中于A～E群，其中，鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和肠炎沙门氏菌最为常见。在世界各国各类细菌性的食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒高居前列。人畜感染沙门氏菌后可能加重病症或加大死亡率，也可能会降低动物繁殖力，造成巨大的经济损失，并严重威胁人民群众的身体健康和畜牧业的健康发展，对其防治历来是公共卫生的一项重要课题。快速、准确、简便地检测出沙门氏菌,在医疗卫生、食品卫生、动物疫病监测等方面具有重要的意义。检测沙门氏菌一直以传统检测方法为主，非选择性和选择性增菌、可疑细菌分离等常规方法虽然经典可靠，但程序复杂、十分繁琐，不仅费时费力而且敏感性和特异性较差，漏检率较高。而免疫荧光法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、聚合酶链反应(PCR)技术等方法需要使用指定的仪器设备、具备相应的试验条件和技能，难以在基层推广。胶体金标记免疫分析法是近年兴起并快速发展的一种新型分析技术，其特点是快捷简便、成本低、无污染且无需培训，非常适合现场检测。与ELISA相比，具有显色时间短、无需仪器等优点，具有广阔的市场前景和应用价值。本研究采用猪霍乱沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌免疫兔制得的兔抗沙门氏菌多抗血清,研制胶体金试纸条用于临床快速检测。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术一个方面提供了一种沙门氏菌的检测试纸，其包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向，所述底板上依次组装有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中，所述胶体金垫上含有胶体金标记的沙门氏菌抗体，所述硝酸纤维素膜上进一步形成有检测线和对照线，所述检测线由能与沙门氏菌结合的沙门氏菌抗体划膜制成，所述对照线由能与沙门氏菌抗体结合的羊抗兔抗体划膜制成。其中，所述胶体金标记的沙门氏菌抗体通过以下方法制得：取100单位体积的双蒸水煮沸然后加入1单位体积的1％氯金酸溶液，继续煮沸1-10min，然后加入3单位体积的1％的柠檬酸三钠，搅拌至液体颜色由灰色变成黑色再变成紫色，再煮沸至液体颜色变为酒红色，再加双蒸水至100单位体积，获得胶体金溶液；优选地，所述胶体金溶液在520nm和535nm处的吸光值为0.8-1.0；调节胶体金溶液的pH至8.0；在胶体金溶液中加入沙门氏菌抗体至沙门氏菌抗体的浓度为8-11μg/mL(9.6μg/mL)，混匀后加入10％PEG20000至PEG20000的浓度为1％，获得纯化前的胶体金标记的沙门氏菌抗体；将胶体金标记的沙门氏菌抗体以2000r/min，4℃离心20min，弃去沉淀；将上一步所得上清以10000r/min，4℃离心30min，弃去上清；用0.05mol/L的TBS(内含1％BSA，0.05％NaN3)缓冲液溶解沉淀至纯化前的原体积，重复前两步的离心2～3次，将沉淀溶于1/10TBS(内含1％BSA,0.05％NaN3)中至纯化前原体积，4℃保存备用，获得纯化后的胶体金标记的沙门氏菌抗体。其中，所述胶体金垫是经过是BSA、SDS和Tween-20处理过的，优选地，所述胶体金垫通过如下方法制得：配制胶体金垫处理液：用pH7.4的PBS加入1％的BSA、0.5％的SDS、1％的Tween-20混匀后过滤；把玻璃纤维膜放置于胶体金处理液中浸泡30min，37℃烘干；将胶体金标记的沙门氏菌抗体以5μL/cm的喷量喷涂于经处理液处理过的玻璃纤维素膜上，烘干。其中，所述样品垫是经过是BSA、SDS和Tween-20处理过的，优选地，所述样品垫通过如下方法制得：配制样品垫处理液：用pH7.4的PBS加入1％的BSA、0.5％的SDS、1％的Tween-20混匀后过滤；把样品垫放置于胶体金处理液中浸泡30min，37℃烘干。其中，设置检测线和对照线的硝酸纤维素膜是将沙门氏菌抗体稀释为2mg/mL，羊抗兔抗体稀释为2mg/mL，并分别以1μL/cm的剂量在硝酸纤维素膜上进行划膜，划膜后烘干。本专利技术的另一个方面提供了一种沙门氏菌检测试纸的制备方法，其包括如下步骤：1)制备胶体金标记的沙门氏菌抗体：1-1)取100单位体积的双蒸水煮沸然后加入1单位体积的1％氯金酸溶液，继续煮沸1-10min，然后加入3单位体积的1％的柠檬酸三钠，搅拌至液体颜色由灰色变成黑色再变成紫色，再煮沸至液体颜色变为酒红色，再加双蒸水至100单位体积，获得胶体金溶液；优选地，所述胶体金溶液在520nm和535nm处的吸光值为0.8-1.0；1-2)调节胶体金溶液的pH至8.0；在胶体金溶液中加入沙门氏菌抗体至沙门氏菌抗体的浓度为8-11μg/mL(9.6μg/mL)，混匀后加入10％PEG20000至PEG20000的浓度为1％，获得纯化前的胶体金标记的沙门氏菌抗体；1-3)将胶体金标记的沙门氏菌抗体以2000r/min，4℃离心20min，弃去沉淀；1-4)将上一步所得上清以10000r/min，4℃离心30min，弃去上清；1-5)用0.05mol/L的TBS(内含1％BSA，0.05％NaN3)缓冲液溶解沉淀至纯化前的原体积，重复前两步的离心2～3次，将沉淀溶于1/10TBS(内含1％BSA,0.05％NaN3)中至纯化前原体积，4℃保存备用，获得纯化后的胶体金标记的沙门氏菌抗体；2)制备胶体金垫：2-1)配制胶体金垫处理液：用pH7.4的PBS加入1％的BSA、0.5％的SDS、1％的Tween-20混匀后过滤；2-2)把玻璃纤维膜放置于胶体金处理液中浸泡30min，37℃烘干；2-3)将胶体金标记的沙门氏菌抗体以1μL/cm的喷量喷涂于经处理液处理过的玻璃纤维素膜上，烘干；3)制备样品垫：3-1)配制样品垫处理液：用pH7.4的PBS加入1％的BSA、0.5％的SDS、1％的Tween-20混匀后过滤；3-2)把样品垫放置于胶体金处理液中浸泡30min，37℃烘干；4)制备设置检测线和对照线的硝酸纤维素膜：4-1)将沙门氏菌抗体稀释为2mg/mL，羊抗兔抗体稀释为2mg/mL，并分别以1μL/cm的剂量在硝酸纤维素膜上划膜，划膜后烘干；5)组装：依次将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维膜和吸水垫粘贴在底板上即得。本专利技术另一个方面提供了前述的检测试纸在检测沙门氏菌中的应用。本专利技术另一个方面提供了一种非诊断目的的检测沙门氏菌的方法，其包括以下步骤：a)对待测样品进行预处理；b)将预处理获得的待测样品以前述的检测试纸进行检测；其中，步骤1)为：a-1)将待测样品匀浆，并加入缓冲蛋白胨水中，混匀后37℃培养8-18h；a-2)取步骤a-1)培养液1ml-10ml，加入四硫酸钠煌绿增菌液中42℃培养18-24h；a-3)取步骤a-2)培养液1ml-10ml，加入亚硒酸盐胱氨酸增菌液中37℃培养18-24h；优选地，检测步骤设立阳性对照。本试验是将胶体金与沙门氏菌抗体的偶联物喷涂在玻璃纤维膜的胶体金垫上，沙门氏菌抗体和羊抗兔抗体分别喷于本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种沙门氏菌的检测试纸，其包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向，所述底板上依次组装有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中，所述胶体金垫上含有胶体金标记的沙门氏菌抗体，所述硝酸纤维素膜上进一步形成有检测线和对照线，所述检测线由能与沙门氏菌结合的沙门氏菌抗体划膜制成，所述对照线由能与沙门氏菌抗体结合的羊抗兔抗体划膜制成。

【技术特征摘要】
1.一种沙门氏菌的检测试纸，其包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向，所述底板上依次组装有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中，所述胶体金垫上含有胶体金标记的沙门氏菌抗体，所述硝酸纤维素膜上进一步形成有检测线和对照线，所述检测线由能与沙门氏菌结合的沙门氏菌抗体划膜制成，所述对照线由能与沙门氏菌抗体结合的羊抗兔抗体划膜制成。2.根据权利要求1所述的检测试纸，其中，所述胶体金标记的沙门氏菌抗体通过以下方法制得：取100单位体积的双蒸水煮沸然后加入1单位体积的1％氯金酸溶液，继续煮沸1-10min，然后加入3单位体积的1％的柠檬酸三钠，搅拌至液体颜色由灰色变成黑色再变成紫色，再煮沸至液体颜色变为酒红色，再加双蒸水至100单位体积，获得胶体金溶液；优选地，所述胶体金溶液在520nm和535nm处的吸光值为0.8-1.0；调节胶体金溶液的pH至8.0；在胶体金溶液中加入沙门氏菌抗体至沙门氏菌抗体的浓度为8-11μg/mL(9.6μg/mL)，混匀后加入10％PEG20000至PEG20000的浓度为1％，获得纯化前的胶体金标记的沙门氏菌抗体；将胶体金标记的沙门氏菌抗体以2000r/min，4℃离心20min，弃去沉淀；将上一步所得上清以10000r/min，4℃离心30min，弃去上清；用0.05mol/L的TBS(内含1％BSA，0.05％NaN3)缓冲液溶解沉淀至纯化前的原体积，重复前两步的离心2～3次，将沉淀溶于1/10TBS(内含1％BSA,0.05％NaN3)中至纯化前原体积，4℃保存备用，获得纯化后的胶体金标记的沙门氏菌抗体。3.根据权利要求2所述的检测试纸，其中，所述沙门氏菌抗体是通过以下方法获得的：以沙门氏菌用培养基沙门氏菌，培养后取两株呈现沙门氏菌特征性的菌落并扩大培养，保存备用；测得菌液浓度约为1×1010CFU，细菌用0.3％的甲醛灭活24小时，灭活后菌液经细菌检验平板不再长菌；将灭活后的菌液加入弗氏不完全佐剂制作成疫苗用于免疫新西兰白兔，1mL菌液/只，背部皮下注射，共免疫4次，每次间隔15天，采用同样方法再连续注射4次，四疫前兔耳静脉采血检测抗体生成情况；经测试合格者颈动脉采血，分离血清，即得沙门氏菌抗体。4.根据权利要求1-3任一项所述的检测试纸，其中，所述胶体金垫是经过是BSA、SDS和Tween-20处理过的，优选地，所述胶体金垫通过如下方法制得：配制胶体金垫处理液：用pH7.4的PBS加入1％的BSA、0.5％的SDS、1％的Tween-20混匀后过滤；把玻璃纤维膜放置于胶体金处理液中浸泡30min，37℃烘干；将胶体金标记的沙门氏菌抗体以5μL/cm的喷量喷涂于经处理液处理过的玻璃纤维素膜上，烘干。5.根据权利要求1-3任一项所述的检测试纸，其中，所述样品垫是经过是BSA、SDS和Tween-20处理过的，优选地，所述样品垫通过如下方法制得：配制样品垫处理液：用pH7.4的PBS加入1％的BSA、0.5％的SDS、1％的Tween-20混匀后过滤；把样品垫放置于胶体金处理液中浸泡...

【专利技术属性】
技术研发人员：李俊，彭喆，黄保华，时建立，王莉莉，王金宝，徐绍建，吴晓燕，朱晓琳，郑书轩，张玲玲，
申请(专利权)人：山东省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37