从血浆中分离用于治疗阿尔兹海默症的混合物的方法及混合物和应用技术

本发明专利技术公开了一种从血浆中分离用于治疗阿尔兹海默症的混合物的方法及混合物和应用。该混合物的分离方法依次包括血浆收集、密度梯度离心、透析、一次浓缩、去高峰度蛋白、阴离子交换以及二次浓缩步骤。该混合物包括多种蛋白质和多种小分子，所述混合物的SDS‑PAGE变性胶电泳包括至少30个条带，其中在分子量大于48kD的条带中包括明显可见的7个条带，所述7个条带的分子量从小到大依次是56kD，68kD，77kD，115kD，175kD，250kD和289kD。本发明专利技术制备的该混合物可以用于预防、改善和治疗阿尔兹海默症，还可以起到增强记忆力的作用。

Methods and compositions for the separation of mixtures from plasma for the treatment of Alzheimer's disease

The invention discloses a method for separating a mixture from plasma to treat Alzheimer's disease, a mixture and an application thereof. The method of separation of the mixture comprises the following steps: plasma collection, density gradient centrifugation, dialysis, primary concentration, off peak protein, anion exchange, and two concentration steps. The mixture includes a variety of a variety of proteins and small molecules, the mixture of SDS PAGE denaturing gel electrophoresis including at least 30 bands, in which molecular weight greater than 48kD including 7 clear bands in the 7 bands with molecular weight increases from 56kD, 68kD, 77kD. 115kD, 175kD, 250kD and 289kD. The mixture prepared by the invention can be used for preventing, improving and treating Alzheimer's disease, and can also enhance the memory function.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种血浆分离物，具体地，涉及一种从血浆中分离用于治疗阿尔兹海默症的混合物的方法及混合物和应用，该混合物可用于预防、改善和治疗阿尔兹海默症，并具有增强记忆力的作用。
技术介绍
阿尔兹海默综合症又叫阿尔兹海默症，其特点是病人的记忆和认知能力逐渐丧失。病人在确诊后3到9年内死亡，占临床死亡病例的50％到56％。该病病因目前的认识是大脑内积累的异常折叠的beta-淀粉样蛋白和Tau蛋白导致了阿尔兹海默症。阿尔兹海默症目前市场上的药物主要是西药，其特征是必须长期坚持服用，然而却疗效微小，只能缓解部分症状，不能控制病情的发展。长期服用的另外一个缺陷是药物副作用大，同时病人产生药物依赖性。为此市场上急需疗效更好，副作用性更低的药物。目前的最新研究表明：给年老老鼠持续注射年轻老鼠的血浆能提升年老老鼠的认知水平(VilledaS.A.Youngbloodreversesage-relatedimpairmentsincognitivefunctionandsynapticplasticityinmice.NatureMedicine2014；20:659-663)。为此，血浆中可能含有某些物质能有效的提升阿尔兹海默症患者的认知水平。但是，这些物质的具体组分、以及分离获取方法还未见报道。
技术实现思路
针对现有技术的缺陷，本专利技术的目的之一在于提供一种从血浆中分离用于治疗阿尔兹海默症的混合物的方法。本专利技术的目的之二在于提供采用上述方法分离到的用于治疗阿尔兹海默症的混合物。本专利技术的目的之三在于提供上述混合物的应用。为了实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种从血浆中分离用于治疗阿尔兹海默症的混合物的方法，依次包括如下步骤：血浆收集步骤、密度梯度离心步骤、透析步骤、一次浓缩步骤、去高峰度蛋白步骤、阴离子交换步骤以及二次浓缩步骤。在上述方法中，作为一种优选实施方式，在所述血浆收集步骤中，利用抗凝管收集血液，再通过离心收集上清液，得到血浆；优选地，所述离心转速为500-1500g，离心时间为10-30分钟。在上述方法中，作为一种优选实施方式，在所述密度梯度离心步骤中，将所述血浆收集步骤得到的血浆与Percoll溶液、Forcol溶液或蔗糖溶液混合，建立密度梯度并离心，之后将离心管中最上层红色部分去掉，得到密度梯度离心后产物，其中所述离心的条件为：转速为10000-30000g，时间为2-20h；优选地，所述Percoll溶液、Forcol溶液或蔗糖溶液的浓度为40-60％，所述Percoll溶液、Forcol溶液或蔗糖溶液与所述血浆的体积比为(10-15):(1-3)。在上述方法中，作为一种优选实施方式，在所述透析步骤中，将所述密度梯度离心后的产物放入透析袋或管中进行透析，透析后收集透析袋或管中的产物，作为透析产物；其中所述透析时使用的透析缓冲液为Tris-盐酸缓冲液，磷酸缓冲液或HBS缓冲液；优选地，所述Tris-盐酸缓冲液的浓度为0.2-200mM、pH值为7.0-9.2，所述磷酸缓冲液的浓度为1.0-500mM、pH值为6.0-9.2，所述HBS缓冲液的浓度为0.5-500mM、pH值为6.4-8.4；更优选地，所述透析缓冲液为1mM、pH值为8的Tris盐酸缓冲液；透析时间为20-72h，透析体积比是1:100-1:10000。在上述方法中，作为一种优选实施方式，在所述一次浓缩步骤中，将所述透析产物进行浓缩，得到一次浓缩后产物，其中浓缩前体积是浓缩后体积的10倍以上；优选地，所述浓缩是采用浓缩管离心的方式进行的，所述浓缩管允许1.5-2.5KD的物质通过，所述离心时转速为2000-4000g。在上述方法中，作为一种优选实施方式，在所述去高峰度蛋白步骤中，采用去高峰度蛋白试剂盒将一次浓缩后产物中的高峰度蛋白去掉，得到去高峰度蛋白产物；优选地，所述去高峰度蛋白试剂盒中的洗脱缓冲液对去高峰度蛋白柱子上的一次浓缩后产物进行洗脱时得到的洗脱液，为所述去高峰度蛋白产物；优选地，去掉的所述高峰度蛋白的含量是5mg/ml。在上述方法中，作为一种优选实施方式，在所述阴离子交换步骤中，将所述去高峰度蛋白产物加到阴离子交换柱中，用含有20-500mM氯化钠的Tris-盐酸缓冲液进行梯度洗脱，当洗脱体积为15-35ml时开始收集洗脱液，当洗脱体积为40-85ml时停止收集洗脱液，收集得到的洗脱液为阴离子交换后产物；优选地，所述Tris-盐酸缓冲液的浓度为0.2-200mM、pH值为7.0-9.2。在上述方法中，作为一种优选实施方式，在所述二次浓缩步骤中，将所述阴离子交换后产物进行浓缩，得到二次浓缩后产物即所述混合物，其中浓缩前体积是浓缩后体积的10倍以上；优选地，所述浓缩是采用浓缩管离心的方式进行的，所述浓缩管允许1.5-2.5KD的物质通过，所述离心时转速为2000-4000g。在上述方法中，作为一种优选实施方式，所述血浆来源于哺乳动物；优选地，所述血浆来源于人。采用上述方法分离出的用于治疗阿尔兹海默症的混合物，所述混合物包括多种蛋白质和多种小分子，所述混合物的SDS-PAGE变性胶电泳包括至少30个条带，其中在分子量大于48kD的条带中包括：分子量从小到大依次是56kD，68kD，77kD，115kD，175kD，250kD和289kD的条带。在上述混合物中，作为一种优选实施方式，所述混合物的FPLC鉴定具有4个峰，对应的蛋白大小分别是：250kD，120kD，100kD和80kD。在上述混合物中，作为一种优选实施方式，通过蛋白质谱分析，所述混合物至少含有30个蛋白，包括白蛋白，球蛋白，角蛋白，纤维蛋白原和转运蛋白；通过小分子质谱分析，所述混合物还至少含有20个小分子。在上述混合物中，作为一种优选实施方式，通过蛋白质谱分析，所述混合物所含蛋白如下：在上述混合物中，作为一种优选实施方式，通过小分子质谱分析，所述混合物所含的小分子如下：一种药物组合物，包含上述混合物和药学上可接受的载体。上述混合物和上述药物组合物在预防、改善或/和治疗记忆力减退类疾病的药物中的应用；优选地，所述记忆力减退类疾病为阿尔兹海默症。上述混合物和上述药物组合物在增强记忆力药物中的应用。相比于现有技术，本专利技术具有如下有益效果：1、本专利技术制备的该血浆组分可以用于预防、改善和治疗阿尔兹海默症，该血浆组分经验证可以延缓阿尔兹海默症的疾病进程并有可能逆转阿尔兹海默症的病理性严重程度，此外其还可以起到增强记忆力的作用。2、本专利技术提供的从血浆中分离出的混合物可以比血浆和目前药物更有效的提升阿尔兹海默症患者的认知水平。与此同时，长期服用这种血浆组分可以大大降低长期服用西药带来的副作用和药物依赖。附图说明图1：鸡尾酒组分Ⅰ(即本专利技术的从血浆中分离出的混合物)制备阴离子柱层析结果。小鼠血浆经过密度梯度离心、透析、浓缩和去高峰度蛋白后，进行阴离子柱层析。使用阴离子柱SourceQ吸附蛋白，再用含500mM氯化钠的Tris缓冲液进行梯度洗脱，得到洗脱曲线。当洗脱体积为35毫升时开始收集洗脱液，当洗脱体积为45毫升时停止收集洗脱液。收集的洗脱液经过浓缩后即为鸡尾酒组分Ⅰ。图2：鸡尾酒组分ⅠSDS-变性胶电泳鉴定结果。泳道M：蛋白分子量标准；泳道1-3：鸡尾酒组分。图3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从血浆中分离用于治疗阿尔兹海默症的混合物的方法，其特征在于，依次包括如下步骤：血浆收集步骤、密度梯度离心步骤、透析步骤、一次浓缩步骤、去高峰度蛋白步骤、阴离子交换步骤以及二次浓缩步骤。

【技术特征摘要】
1.一种从血浆中分离用于治疗阿尔兹海默症的混合物的方法，其特征在于，依次包括如下步骤：血浆收集步骤、密度梯度离心步骤、透析步骤、一次浓缩步骤、去高峰度蛋白步骤、阴离子交换步骤以及二次浓缩步骤。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述血浆收集步骤中，利用抗凝管收集血液，再通过离心收集上清液，得到血浆；优选地，所述离心转速为500-1500g，离心时间为10-30分钟。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述密度梯度离心步骤中，将所述血浆收集步骤得到的血浆与Percoll溶液、Forcol溶液或蔗糖溶液混合，建立密度梯度并离心，之后将离心管中最上层红色部分去掉，得到密度梯度离心后产物，其中所述离心的条件为：转速为10000-30000g，时间为2-20h；优选地，所述Percoll溶液、Forcol溶液或蔗糖溶液的浓度为40-60％，所述Percoll溶液、Forcol溶液或蔗糖溶液与所述血浆的体积比为(10-15):(1-3)。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在所述透析步骤中，将所述密度梯度离心后的产物放入透析袋或管中进行透析，透析后收集透析袋或管中的产物，作为透析产物；其中所述透析时使用的透析缓冲液为Tris-盐酸缓冲液，磷酸缓冲液或HBS缓冲液；优选地，所述Tris-盐酸缓冲液的浓度为0.2-200mM、pH值为7.0-9.2，所述磷酸缓冲液的浓度为1.0-500mM、pH值为6.0-9.2，所述HBS缓冲液的浓度为0.5-500mM、pH值为6.4-8.4；更优选地，所述透析缓冲液为1mM、pH值为8的Tris盐酸缓冲液；透析时间为20-72h，透析体积比是1:100-1:10000。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在所述一次浓缩步骤中，将所述透析产物进行浓缩，得到一次浓缩后产物，其中浓缩前体积是浓缩后体积的10倍以上；优选地，所述浓缩是采用浓缩管离心的方式进行的，所述浓缩管允许1.5-2.5KD的物质通过，所述离心时转速为2000-4000g。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在所述去高峰度蛋白步骤中，采用去高峰度蛋白试剂盒将一次浓缩后产物中的高峰度蛋白去掉，得到去高峰度蛋白产物；优选地，所述去高峰度蛋白试剂盒中的洗脱缓冲液对去高峰度蛋白柱子上的一次浓缩后产物进行洗脱时得到的洗脱液，为所述去高峰度蛋白产物；优选地，去掉的所述高...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔文宏，
申请(专利权)人：田野，
类型：发明
国别省市：北京;11