一种用于胃病检测的试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种胃病检测试剂盒，属于体外试剂诊断技术领域。通过SELEX技术筛选得到能够特异性结合胃蛋白酶原II的核酸适配子，从而利用该适配子来特异性筛选或检测血液中的胃蛋白酶原II，并通过将所述适配子制备成为检测试剂盒可以达到血液不需要稀释直接反应检测减轻工作量的目的；同时获得宽的测量范围，便于临床使用。本发明专利技术的积极意义在于：试剂盒灵敏度高、特异性好、测量范围宽、操作简单，利于大规模推广应用，有广阔的市场前景。

Reagent kit for stomach disease detection

The invention relates to a stomach disease detection reagent kit, which belongs to the field of in vitro reagent diagnosis technology. By SELEX screening specific binding with nucleic acid pepsinogen II aptamer, thus the aptamer to specific screening or detection in blood pepsinogen II and the aptamer prepared as detection kit can reach the blood does not need to dilute direct reaction detection and reduce the workload of purpose; at the same time to obtain a wide measurement range, convenient for clinical use. The invention has the advantages of high sensitivity, good specificity, wide measuring range, simple operation, wide application and wide market prospect.

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请日为2015年11月29日、申请号为201510849189.6、专利技术名称为“一种用于胃病检测的试剂盒”的专利技术专利申请的分案申请。
本申请涉及生物检测领域，具体涉及胃病的检测。
技术介绍
胃蛋白酶原II(简称PGII)来源于全胃腺和远端十二指肠Brunner氏腺，胃粘膜合成的PGII约为总量的25％，PGII大部分进入消化道，少量进入血液循环，因此被称为“反映胃部状态和功能的指针”。国内外临床研究指出，PGII与胃底粘膜病变的相关性较大，其升高与胃底腺管萎缩、肠上皮化生或假幽门腺化生、异型增生有关。测定PGII含量有助检测出十二指肠溃疡、萎缩性胃炎、胃炎、胃癌等其他消化道疾病，供临床检测和体检筛查需求。在人群胃病筛查中，每个人做胃镜是不现实的，可通过非侵入性血清PG检测将浅表性胃炎、糜烂性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、胃癌等高危人群筛查出来，再进行胃镜检查是一种切实可行的方案。现有技术已知采用时间分辨荧光测量技术，组建的PGII的TRFIIA试剂盒是目前PGII检测方法中最灵敏、测量范围最宽的方法之一，但是价格昂贵不利于大规模推广。系统进化指数富集技术(SELEX技术)是20世纪90年代初发展起来的一种新的组合化学技术，其运用大容量的随机寡核苷酸文库，结合体外PCR扩增技术，以指数富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过多轮筛选，获得亲和力高、特异性强的寡核苷酸适配子(aptamers)。该技术己成功运用于许多靶分子的筛选，包括金属离子、有机染料、药物、蛋白质、氨基酸以及各种细胞因子等。
技术实现思路
本专利技术的目的是通过系统进化指数富集技术(SELEX技术)筛选胃蛋白酶原II的寡核苷酸适配子来替代抗体，提供一种简洁快速、高灵敏度、高特异性的胃蛋白酶原II早期检测及分离纯化方法。本专利技术的技术方案：本专利技术中用于系统进化指数富集技术筛选的单链DNA随机文库及引物，由美国invitrogen公司合成，两端为固定序列，中间为42个碱基的随机序列：5'-TACGACATGAACCGTGATAA(N42)CAGTGAAACCTGATGATCGA-3'，库容量为1014以上；引物1:5'–TACGACATGAACCGTGATAA-3'；引物2:5'-TCGATCAGCAGGTTTCACTG-3'。人胃蛋白酶原II根据CN103387971A中公开的重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白的方法制备获得；GelRed核酸染料购于Biotium公司；硝酸纤维素滤膜购于美国密理博(MilliPore)公司；寡聚核苷酸的纯化试剂购于北京天为时代公司；PCR试剂盒和T载体购于美国普洛麦格(ftOmega)公司。一种亲和人胃蛋白酶原II核酸适配子，其特征在于核苷酸序列为：SEQIDNO：1-17任一所示的DNA分子。一种上述亲和人胃蛋白酶原II核酸适配子，其特征在于：具有相同功能的寡核苷酸适配子同源序列占60％以上。一种上述亲和人胃蛋白酶原II核酸适配子，其特征在于：衍生的RNA序列具有相同的功能。一种上述亲和人胃蛋白酶原II核酸适配子，其特征在于：为能与DNA序列进行杂交的寡核苷酸序列。一种上述亲和人胃蛋白酶原II核酸适配子，其特征在于：在核酸适配子的任何位置删除或增加部分寡核苷酸残基所得到的寡核苷酸适配子序列具有相同的功能。一种上述亲和人胃蛋白酶原II核酸适配子，其特征在于：在核酸适配子的任何位置进行核苷酸种类和稀有碱基的置换后，得到的寡核苷酸适配子序列具有相同的功能。一种上述亲和人胃蛋白酶原II核酸适配子，其特征在于：在核酸适配子的任何位置进行磷酸化、甲基化、氨基、巯基、同位素、生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料或酶标记修饰后，得到的寡核苷酸适配子序列具有相同的功能。一种上述亲和人胃蛋白酶原II核酸适配子，其特征在于：用于人胃蛋白酶原II的检测和分离纯化，从而用于脑疾病的检测。一种上述亲和人胃蛋白酶原II核酸适配子的制备方法，按以下步骤进行：1)单链DNA随机寡核苷酸文库的合成；2)利用系统进化指数富集方法对寡核苷酸文库进行筛选；3)扩增与人白蛋白特异结合的寡核苷酸；4)进行下一轮筛选，经过12轮以上筛选后获得目的寡核苷酸序列；5)克隆测序。本专利技术的优点是：具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的适配子具许多优势：1)本身是寡核苷酸，分子量较小，可以化学合成，节约成本；2)具有比抗体更高的亲和性和特异性；3)便于标记且可以在不同部位有选择性的标记；4)重复性和稳定性好，且易于保存，即对高温和剧烈条件不敏感。因此，系统进化指数富集技术具有良好的应用前景。具体实施方式实施例1人胃蛋白酶原II的制备根据CN103387971A中公开的重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白的方法制备获得人胃蛋白酶原II，蛋白浓度为100mg/mL。实施例2合成随机单链DNA文库和引物随机单链DNA(ssDNA)文库:5'-TACGACATGAACCGTGATAA(N42)CAGTGAAACCTGATGATCGA-3'，构建了长度为82nt的随机ssDNA文库，两端为固定引物序列，中间为42个碱基的随机序列，库容量为I014以上；引物1:5'–TACGACATGAACCGTGATAA-3'；引物2:5'-TCGATCAGCAGGTTTCACTG-3'；将随机ssDNA文库和两种引物均用TE缓冲液配制成100μmol/L贮存液_20℃贮存备用。将单链DNA文库扩增为双链DNA,产物经2％琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；以回收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。75μgRNA文库经硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA分子，然后与2ug人胃蛋白酶原II蛋白，37℃孵育30min，反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜；然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲液(6mol/L尿素，0.55mol/L醋酸铵，l.5mmol/LEDTA,0.15％SDS)中煮沸5min，离心，取上清，无水乙醇沉淀RNA，并重新溶解于20μ1DEPC水中；以RNA为模板RT-PCR扩增双链DNA，体外转录出RNA文库用于下一轮筛选；每轮筛选过程中RT-PCR得到双链DNA文库，以该双链DNA为模板体外转录出RNA适配子库，筛选共进行10轮。得到了14个适配子，其序列分别为SEQIDNO:1-14所示。具体序列如下所示：PGII-1：TACGACATGAACCGTGATAACTCATATATGTTCCCAACACGTCCAACTTATCCCTGACAATACAGTGAAACCTGATGATCGAPGII-2：TACGACATGAACCGTGATAACCGCTTCACACACTACCGCTCTCTCTTAGACTATTAACAATTCAGTGAAACCTGATGATCGAPGII-3：TACGACATGAACCGTGATAAATTCATACTTGTACAAATACTCTCGCATCTCCACTTATAATACAGTGAAACCTGATGATCGAPGII-4：TACGACATGAACCGTGATAAATAATTCTTTGCTTACCCTAA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于胃病检测的试剂盒，其含有能与胃蛋白酶原II特异性结合的核酸适体。

【技术特征摘要】
1.一种用于胃病检测的试剂盒，其含有能与胃蛋白酶原II特异性结合的核酸适体。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢美珍，
申请(专利权)人：卢美珍，
类型：发明
国别省市：江西;36