一种微流控装置及利用该装置制备微凝胶的方法制造方法及图纸

本发明专利技术提供了一种微流控装置及利用该装置制备载细胞微凝胶的方法。该方法包括：(1)以含有活细胞或生物活性分子、光固化剂和水凝胶预聚体的溶液作为内相；以含有油和表面活性剂的混合溶液作为中间相；以聚乙烯醇水溶液作为外相；(2)将所述内相、中间相和外相通过微量泵或微注射器分别输送至微流控装置的相应微通道中，形成单分散的水包油包水双乳液；(3)步骤(2)的所述单分散的水包油包水双乳液流经微流控装置的输出通道，收集在装有水性溶液的收集容器中，得固载有活细胞或生物活性分子的微凝胶。实现了一步法固载细胞微凝胶的制备，对所得微凝胶尺寸可控，且尺寸分布窄，同时保持了细胞的存活率。

Microfluidic device and method for preparing microgel using the same

The invention provides a micro fluidic device and a method for preparing a cell gel by using the device. The method comprises the following steps: (1) to a solution containing living cells or biologically active molecules, curing agent and hydrogel prepolymer as internal phase; the mixed solution containing oil and surfactant as an intermediate phase; PVA water solution as foreign minister; (2) the internal and external phase, in between by the micro pump or micro syringe respectively transported to the microfluidic device in the micro channel, the formation of oil in water dispersed water double emulsion; (3) step (2) of the output channel of the oil in water dispersed water double emulsion through a microfluidic device, collected in the collection container with water solution in the micro gel solid containing living cells or biologically active molecules. The preparation of immobilized cell microgel was achieved, and the size of the microgel was controllable and the size distribution was narrow.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程领域，涉及微流控装置以及利用该微流控装置制备载有活细胞或生物活性因子的微凝胶的制备方法。
技术介绍
针对损伤或病变的人体组织或器官的修复，临床上的传统仍依赖于器官捐献。然而，移植人体组织短缺，有引发传染疾病等风险使得器官移植面临诸多问题。仅以美国为例，目前等待器官移植的患者每年超过74000例，而每年只有21000人能够得到移植手术。近年来，以组织工程和细胞治疗为手段的再生医学技术的诞生和发展，给器官修复重建带来了新的希望，并有望缓解器官捐献者短缺的实际问题。其中组织工程是应用工程学和生命科学的原理和方法，利用天然的和合成的成分构建提议恢复、维持或改善组织功能的医疗制品。目前组织工程技术已经相对成功的实现了包括皮肤、软骨等组织的修复并进入临床应用。然而，实现复杂结构的、三维(3D)空间工程化组织尚未生成。其中一个只要技术难题就是在大尺寸支架材料中的活体细胞，由于细胞间信号交换和营养物质交换受到限制，因此难以正常繁殖并组织化，因而导致组织缺损修复失败。生物相容性的、可降解亲水性高分子材料构成的水凝胶可以模拟活体细胞的细胞外微环境，因此被大量用于细胞固载和组织工程方面的应用。然而被包埋在大尺寸水凝胶材料中的活体细胞的细胞间信号交换和营养物质交换都会受到限制。这是因为在微凝胶的交联高分子网络中，信号因子和营养物质的渗透速率和距离都受到限制。相对而言，微米尺度的微凝胶更使用于细胞的固载包埋和三维培养，因为微凝胶有利于物质交换并可对细胞外微环境形成更精确控制。因此，实现载细胞微凝胶的高通量制备将有利于推进组织工程和细胞治疗技术的发展和临床应用。固载有活体细胞的微凝胶可作为基本单元用于构建细胞化的类组织结构，也可以作为药物控释载体用于细胞治疗技术。然而，如何精确控制微凝胶的尺寸和尺寸分布仍然是现有制备工艺技术难点，而这一参数不但会影响物质交换，更会直接影响被载细胞的行为。这需要我们开发新技术来实现对微凝胶性能参数的精确调控，同时保持被固载细胞存活率。现有的可用于载细胞微凝胶的微加工技术包括光刻蚀技术[1]、微模板技术[2,3]等。这些技术都有各自的优势，例如可实现规模化生产、对微凝胶尺寸形貌精确控制等。然而，这些传统技术都是基于批量化的生产工艺，无法实现高通量的连续制备，且批次间产品性能存在差异。微流控液滴技术的发展使精确控制不互溶多相流体成为可能，这一技术可实现连续进样，快速生产单分散性、可精确控制尺寸的微凝胶或微胶囊材料[4]。油包水(W/O)单乳液液滴技术可通过具有T型流道[5]或流体聚焦结构[6]的微流控装置制备，并且可作为模板、通过不同聚合方式制备单分散的微凝胶。然而，该方法不能实现连续的载细胞凝胶生成，而需要不间断的收集产物并破除乳液将细胞转移到生物相容性的水相溶液中，加工过程费时费力。并且，细胞长时间的暴露在油和表面活性剂中会影响细胞的活性[7]。因此，如何实现细胞在被固载入微凝胶并快速从油相中分离将大大有利于细胞活性的保存，并可实现连续制备，提高生产效率。另外，水包水(W/W)乳液技术也可以实现微凝胶的制备[8,9]。该方法使用含水的两相流体，利用两相间不易共混可形成液滴，并以液滴作为模板，实现在水溶液中生产微凝胶微粒。该方法避免了额外的破除乳液的步骤，可实现一步法细胞包埋。然而，这一体系限于特定组合两种不混溶含水溶质，如葡聚糖和聚乙二醇，这限制了这一方法的广泛应用。综上所述，尽管载细胞微凝胶技术在生物医学领域具有重要的应用价值，然而如何实现的细胞固载包埋与微凝胶，并同时维持细胞的存活率，仍然是这一领域重要的技术难题，必须开发出更简单、效率更高、可实现产业化生产的新技术。已有技术存在的缺陷或问题：1)光刻蚀技术、微模板技术、基于离心力的液滴：这些传统技术都是基于批量化的生产工艺，无法实现高通量的连续制备，且批次间产品性能存在差异。2)水包油(W/O)单乳液液滴技术：该方法不能实现连续的载细胞凝胶生成，而需要不间断的收集产物并破除乳液将细胞转移到生物相容性的水相溶液中，加工过程费时费力。并且，细胞长时间的暴露在油和表面活性剂中会影响细胞的活性。3)水包水(W/W)乳液技术：这一体系限于特定组合两种不混溶含水溶质，如葡聚糖和聚乙二醇，这限制了这一方法的广泛应用。
技术实现思路
鉴于上述现有技术中存在的缺陷，本专利技术提供一种固载有活细胞或生物活性分子的微凝胶的一步法连续制备方法，同时提供用于制备所述微凝胶的微流控装置。本专利技术是采用如下技术方案来实现的。一种固载有活细胞或生物活性分子的微凝胶的一步法连续制备方法，包括如下步骤：(1)以含有活细胞或生物活性分子、光固化剂和水凝胶预聚体的溶液作为内相；以含有油和表面活性剂的混合溶液作为中间相；以聚乙烯醇水溶液作为外相；(2)将所述内相、中间相和外相通过微量泵或微注射器分别注入至微流控装置的相应微通道中，形成单分散的水包油包水双乳液；(3)步骤(2)的所述单分散的水包油包水双乳液流经微流控装置的输出通道，收集在装有水性溶液的收集容器中，得固载有活细胞或生物活性分子的微凝胶；其中，在所述输出通道的出口端设置有激发水凝胶预聚体交联的装置；所述注入中间相的微通道内壁表面进行疏水处理；所述输出通道的内壁表面进行亲水处理；所述注入内相的微通道内壁表面进行亲水处理。进一步地，在上述技术方案中，所述水凝胶预聚体在内相中的浓度为0.2-50w/v％，优选为w/v5-10％，更优选为8％w/v；光固化剂在内相中的浓度为0.25-2w/v％，优选为0.5-1w/v％，更优选为0.5w/v％。进一步地，所述表面活性剂在中间相中的浓度为0.1-5v/v％，优选为0.5-1v/v％，更优选为0.5v/v％。进一步地，在上述所有技术方案中，所述聚乙烯醇在聚乙烯醇水溶液中的浓度为1-20w/v％，优选为5-10w/v％，更优选为5w/v％。进一步地，在上述所有技术方案中，所述的激发水凝胶预聚体交联的装置是紫外光源、设置在输出通道输出端外壁上的加热或制冷装置或输出通道内注入离子的离子注入装置中的一种。在上述技术方案中，所述步骤(2)的所述单分散的水包油包水双乳液，最内层为内相，所述单分散的水包油包水双乳液经过设置在输出通道出口端上的所述装置时，内相中的水凝胶预聚体可以快速交联，形成微凝胶。所述紫外光源可诱发光固化聚合物单体的交联，所述设置在输出通道输出端外壁上的加热或制冷装置可诱发温敏性聚合物单体的交联，所述输出通道内注入离子的离子注入装置诱发离子交联聚合物单体的交联。进一步地，在上述所有技术方案中，在步骤(2)中，将所述内相、中间相和外相通过微量泵或微注射器分别以100-2000μLhr-1、100-2000μLhr-1和1000-20000μLhr-1的流速输送至微流控装置的相应微通道中，在出口处形成单分散的水包油包水双乳液。优选地，所述内相的流速与中间相的流速比为0.5:1～4:1，内相和中间相流速总和与外相的流速比为1:5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种固载有活细胞或生物活性分子的微凝胶的一步法连续制备方法，包括如下步骤：(1)以含有活细胞或生物活性分子、光固化剂和水凝胶预聚体的溶液作为内相；以含有油和表面活性剂的混合溶液作为中间相；以聚乙烯醇水溶液作为外相；(2)将所述内相、中间相和外相通过微量泵或微注射器分别注入至微流控装置的相应微通道中，形成单分散的水包油包水双乳液；(3)步骤(2)的所述单分散的水包油包水双乳液流经微流控装置的输出通道，收集在装有水性溶液的收集容器中，得固载有活细胞或生物活性分子的微凝胶；其中，在所述输出通道的出口端设置有激发水凝胶预聚体交联的装置；所述注入中间相的微通道内壁表面进行疏水处理；所述输出通道的内壁表面进行亲水处理；所述注入内相的微通道内壁表面进行亲水处理。

【技术特征摘要】
1.一种固载有活细胞或生物活性分子的微凝胶的一步法连续制备方法，包
括如下步骤：
(1)以含有活细胞或生物活性分子、光固化剂和水凝胶预聚体的溶液作为
内相；以含有油和表面活性剂的混合溶液作为中间相；以聚乙烯醇水溶液作为
外相；
(2)将所述内相、中间相和外相通过微量泵或微注射器分别注入至微流控
装置的相应微通道中，形成单分散的水包油包水双乳液；
(3)步骤(2)的所述单分散的水包油包水双乳液流经微流控装置的输出
通道，收集在装有水性溶液的收集容器中，得固载有活细胞或生物活性分子的
微凝胶；
其中，在所述输出通道的出口端设置有激发水凝胶预聚体交联的装置；所
述注入中间相的微通道内壁表面进行疏水处理；所述输出通道的内壁表面进行
亲水处理；所述注入内相的微通道内壁表面进行亲水处理。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述水凝胶预聚体在内
相中的浓度为0.2-50w/v％，光固化剂在内相中的浓度为0.25-2w/v％。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述表面活性剂在中间
相中的浓度为0.1-5v/v％。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述在聚乙烯醇水溶液
中聚乙烯醇的浓度为1-20w/v％。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的激发水凝胶预聚
体交联的装置是紫外光源、设置在输出通道出口端外壁上的加热或制冷装置或
输出通道内注入离子的离子注入装置中的一种。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，将所
述内相、中间相和外相通过微量泵或微注射器分别以100-2000μLhr-1、100-2000
μLhr-1和1000-20000μLhr-1的流速输送至微流控装置的相应微通道中，形成单
分散的水包油包水双乳液。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述内相流速与中间相
流速的比为0.5:1～4:1，内相流速和中间相流速的总和与外相流速比为1:5～1:50。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的水凝胶预聚体为
可光固化聚合物单体、可离子交联的聚合物单体、温敏性的聚合物单体或其他
可实现快速交联固化的水凝胶预聚体中的一种。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的可光固化聚合物
单体为聚乙二醇双丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯或二丙烯酸酯接枝的水溶性高分子
中的一种；所述的可离子交联的聚合物单体为多糖类亲水性高分子海藻酸钠或
壳聚糖中的一种；温敏性的聚合物单体为明胶、聚(N-异丙基丙烯酰胺)或琼
脂糖中的一种。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的细胞选自原代
培养细胞、传代培养细胞、细胞株培养细胞和杂合体中的一种；所述生物活性
分子选自具有生物活性的药物、蛋白质和信号因子中的一种。
11.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的光固化剂为1-[4-
(2-羟基乙氧基)-苯基]-2-羟基-2-甲基-1-丙烷-1-酮、1-羟基己基苯基酮或安息
香双甲醚中的一种。
1...

【专利技术属性】
技术研发人员：王华楠，
申请(专利权)人：王华楠，
类型：发明
国别省市：辽宁;21