通过酶的PH-稳定化来提高产率制造技术

本发明专利技术涉及提高来源于亲本酶的变体酶的产率或生产力的方法，所述方法包括选择产生变体酶的宿主细胞的步骤，该变体酶至少具有该亲本酶的酶比活性以及在5‑9的pH范围内的提高的pH‑稳定性。

PH- yield was increased by enzymatic stabilization

The method yields or productivity variants of the present invention relates to improved enzyme derived from the parental enzyme, the method includes selection of the variant enzymes of the host cell steps, the variant enzyme has at least the parental enzyme specific enzyme activity and improve in the 5 9 pH in the range of pH stability.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对序列表的引用本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用结合在此。专利
本专利技术涉及提高来源于亲本酶的酶变体的产率或生产力的方法，所述方法包括选择产生酶变体的宿主细胞的步骤，该酶变体至少具有亲本酶的酶比活性以及在5-9的pH范围内的提高的pH-稳定性。专利技术背景长期以来，酶被蛋白质工程化以便产生人工变体，以提供或调节某些感兴趣的特性，例如，pH依赖性活性、热稳定性、底物裂解模式、裂解比活性、底物特异性和/或底物结合(WO0151620A2)。鉴定适合作为蛋白质工程化的靶标以提高感兴趣的酶的产率或生产力的筛选特性对于酶的工业化制造而言将是非常令人感兴趣的。
技术实现思路
在于此提供的实例中，出人意料地显示出酶的pH稳定性的增加(即，酶在一定pH水平下经过一些时间之后保留其活性的能力的增加)与产率和/或生产力的显著提高相关。因此，在本专利技术的第一方面提供了提高酶的产率和/或生产力的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供宿主细胞，该宿主细胞包括编码感兴趣的亲本酶的一种或多种变体的突变多核苷酸的表达基因文库，其中与亲本酶相比，该一种或多种变体包括至少一个氨基酸改变；b)在有益于产生该一种或多种变体酶的条件下培养宿主细胞；c)选择产生变体酶的宿主细胞，该变体酶至少具有亲本酶的酶比活性以及在5-9的pH范围内的提高的pH-稳定性，其中与亲本的产率和/或生产力相比，该变体酶的产率和/或生产力得到提高；并且任选地d)回收该变体酶。附图简要说明图1示出了实例1的枯草芽孢杆菌MDT99(包括染色体整合亲本普鲁兰酶编码基因的极低蛋白酶(δ-11)菌株)的普鲁兰酶表达水平，其与枯草芽孢杆菌HyGe380(具有染色体整合变体8编码基因的相同背景宿主菌株)的普鲁兰酶表达水平进行比较。结果显示变体8具有提高的表达。专利技术详述本专利技术的第一方面提供了提高酶的产率和/或生产力的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供宿主细胞，该宿主细胞包括编码感兴趣的亲本酶的一种或多种变体的突变多核苷酸的表达基因文库，其中与亲本酶相比，该一种或多种变体包括至少一个氨基酸改变；b)在有益于产生该一种或多种变体酶的条件下培养宿主细胞；c)选择产生变体酶的宿主细胞，该变体酶至少具有亲本酶的酶比活性以及在5-9的pH范围内的提高的pH-稳定性，其中与亲本的产率和/或生产力相比，该变体酶的产率和/或生产力得到提高；并且任选地d)回收该变体酶。编码序列：术语“编码序列”或“编码……的多核苷酸”意指直接指定多肽氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架从起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本专利技术的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。表达载体：术语“表达载体”意指线性或环状DNA分子，该分子包括编码多肽的多核苷酸并且该多核苷酸可操作地与提供用于其表达的控制序列相连接。突变的多核苷酸：编码本专利技术多肽的多核苷酸的修饰对于合成基本上类似于该多肽的多肽可以是必需的。术语“基本上类似”于该多肽是指该多肽的非天然存在的形式。这些多肽可能以某种工程化方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如在比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的变体。这些变体可以基于以SEQIDNO:1、SEQIDNO:3或SEQIDNO:15的成熟多肽编码序列(例如其子序列)形式呈现的多核苷酸，和/或通过引入不会改变该多肽的氨基酸序列，但对应于预期用于产生该酶的宿主有机体的密码子用法的核苷酸取代，或通过引入可能产生不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸取代的一般描述，参见例如福德(Ford)等人，1991，蛋白质表达与纯化(ProteinExpressionandPurification)2:95-107。可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO95/17413；或WO95/22625披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA7:127)。可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(NatureBiotechnology)17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979，在蛋白质(TheProteins)，学术出版社(AcademicPress)，纽约中描述。常见的取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、以及Asp/Gly。可替代地，氨基酸改变具有这样的性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以改进多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH等。可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁汉(Cunningham)和威尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-10本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高酶的产率和/或生产力的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供宿主细胞，该宿主细胞包括编码感兴趣的亲本酶的一种或多种变体的突变多核苷酸的表达基因文库，其中与该亲本酶相比，该一种或多种变体包括至少一个氨基酸改变；b)在有益于产生该一种或多种变体酶的条件下培养该宿主细胞；c)选择产生变体酶的宿主细胞，该变体酶至少具有该亲本酶的酶比活性以及在5‑9的pH范围内的提高的pH‑稳定性，其中与该亲本的产率和/或生产力相比，该变体酶的产率和/或生产力得到提高；并且任选地d)回收该变体酶。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.01.13 EP 14150949.71.一种提高酶的产率和/或生产力的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供宿主细胞，该宿主细胞包括编码感兴趣的亲本酶的一种或多种变体的突变多核苷酸的表达基因文库，其中与该亲本酶相比，该一种或多种变体包括至少一个氨基酸改变；b)在有益于产生该一种或多种变体酶的条件下培养该宿主细胞；c)选择产生变体酶的宿主细胞，该变体酶至少具有该亲本酶的酶比活性以及在5-9的pH范围内的提高的pH-稳定性，其中与该亲本的产率和/或生产力相比，该变体酶的产率和/或生产力得到提高；并且任选地d)回收该变体酶。2.如权利要求1所述的方法，其中该亲本酶是一种选自下组的酶，该组由以下各项组成：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶；优选地，该亲本酶是α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变位酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、普鲁兰酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶；更优选地，该亲本酶是普鲁兰酶GH13_14；并且最优选地，该亲本酶是来自芽孢杆菌属的普鲁兰酶。3.如权利要求1或2所述的方法，其中该亲本酶是由与SEQIDNO:1、SEQIDNO:3或SEQIDNO:15的多核苷酸序列具有至少60％序列一致性的多核苷酸编码的普鲁兰酶。4.如任何以上权利要求所述的方法，其中该亲本酶是与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:16的多肽序列具有至少60％序列一致性的普鲁兰酶。5.如任何以上权利要求所述的方法，其中该宿主细胞是原核宿主细胞，优选革兰氏阳性细菌；更优选地是选自下组的属的革...

【专利技术属性】
技术研发人员：松井知子，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK