猴SRV1病毒抗体的免疫梳检测试纸及制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种猴SRV1病毒抗体的免疫梳检测试纸及制备方法和应用。用于制建免疫梳的重组质粒pGEX-4T-SRV1，如序列表Seq No.3所示。用于构建重组质粒的引物对，上引物SRV1F：如序列表Seq No.1所示；下引物SRV1R：如序列表Seq No.2所示。构建方法，包括如下步骤：根据猴SRV1病毒的核苷酸序列设计SOE-PCR引物对；进行SOE-PCR扩增猴SRV1基因；构建重组质粒pGEX-4T-SRV1。最后利用酶联免疫原理和膜层析技术制成快速检测实验猴血液或血清中的抗体的免疫梳。免疫梳具有良好的稳定性、特异性、敏感性及重复性。

Immune comb test paper for simian SRV1 virus antibody, preparation method and application thereof

The present invention provides an immune comb test paper for simian SRV1 virus antibody and its preparation method and application. Recombinant plasmid for pGEX-4T-SRV1 system to build the immune comb, as shown in No.3 Seq sequence list. For the construction of recombinant plasmid primer, primer on SRV1F Seq No.1: such as the order list is shown; under the primer SRV1R: such as Seq No.2 shown in the sequence list. The method includes the following steps: according to the nucleotide sequence of simian SRV1 virus, SOE-PCR primers are designed to amplify the SRV1 gene of monkey SOE-PCR, and the recombinant plasmid pGEX-4T-SRV1 is constructed. Finally, the immune comb for rapid detection of antibodies in blood or serum of experimental monkeys was made by the principle of enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and membrane chromatography. It has good stability, specificity, sensitivity and repeatability.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物
的检测方法及抗原
，具体涉及一种猴SRV1病毒抗体的免疫梳检测试纸及制备方法和应用。
技术介绍
猴D型反转录病毒(simiantype-Dretrovirus，SRV)属反转录病毒科、D型反转录病毒属，与猴免疫缺陷病毒(simianimmunodeficiencyvirus,SIV)同为猴获得性免疫缺陷综合征(SAIDS)的一种致病病毒。目前已发现的SRV有5个血清型：SRV-1，2，3，4，5。SRV主要的靶细胞是淋巴细胞，感染后可造成淋巴细胞耗竭，诱发免疫缺陷。各型SRV的发生有其种属性和群体性，一旦传入易感猴群，可使80%以上的猴发病致死。SRV自然宿主是猕猴，而我国是世界上猕猴的一个主要分布区，遍及东南各省，尤其是海南、云南、广西、四川、贵州和福建等省区，每年都有一定数量的猕猴出口欧美地区，同时也从东南亚地区进口一定数量的猕猴。自美国从中国进口的猴子中分离到SRV-5病毒以来，我国也开始了对国内猕猴SRV的检测。SRV感染的诊断除了检查临床症状，还要结合实验室诊断方法，常用的实验室诊断方法有聚合酶链式反应（PCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接免疫荧光（IFA）、免疫印迹（WesternBlot）、病毒分离等。免疫梳方法是能够对病毒血清抗体进行定性、定量检测的一项新型体外诊断技术，这种技术突破性地将病毒抗原点布在具有极强蛋白吸附力的硝酸纤维膜上，把包被好的抗原膜贴附于PVC板以增加膜的强度和硬度，经机器裁切制成免疫梳。将此免疫梳插入稀释好的待检血清样本时，特异性抗体与抗原结合并固着于膜上，再通过酶标二抗底物反应，染色后，抗体阳性的样本表现为肉眼可见的红色斑点，阴性则无颜色变化。膜经过图像处理系统数据化后可以进行定量分析。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服当前技术在推广使用中存在的缺陷，提供一种猴SRV1病毒抗体的免疫梳检测试纸及制备方法和应用。本专利技术是通过以下的技术方案实现的：1、一种用于构建猴SRV1病毒抗体的免疫梳的SOE-PCR引物组，引物SRV1F：如序列表SeqNo.1所示，引物SRV1R：如序列表SeqNo.2所示。2、一种用于制备猴SRV1病毒抗体的免疫梳的重组表达载体pGEX-4T-SRV1，序列如序列表SeqNo.3所示。3、一种用于制备猴SRV1病毒抗体的免疫梳的重组表达载体pGEX-4T-SRV1的构建方法，包括如下步骤：（1）根据猴SRV1病毒的基因序列，设计SOE-PCR扩增引物，引物SRV1F：如序列表SeqNo.1所示，引物SRV1R：如序列表SeqNo.2所示；（2）进行SOE-PCR扩增猴SRV1病毒基因；（3）猴SRV1病毒基因的回收；（4）克隆质粒pMD18T-SRV1的构建及测序；（5）表达载体pGEX-4T-SRV1的构建，序列如序列表SeqNo.3所示。4、如上所述的一种用于制备猴SRV1病毒抗体的免疫梳的重组表达载体pGEX-4T-SRV1的构建方法，所述的步骤（2）采用SOE-PCR反应的具体步骤如下：将混合液在95℃预变性5min，94℃变性1min，63℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃总延伸10min；上述混合液如下所示：SRV1F引物2μLSRV1R引物2μL2×TaqMasterMix15μL超纯水补足至30μL。5、如上所述的一种用于制备猴SRV1病毒抗体的免疫梳的重组表达载体pGEX-4T-SRV1的构建方法，所述的步骤（5）pGEX-4T-SRV1的构建方法具体步骤如下：利用EcoRⅠ与XhoⅠ分别将pMD18T-SRV1和pGEX-4T-1进行双酶切，并胶回收酶切的目的片段，将回收的目的片段进行连接，将连接产物转化到BL21（DE3）pLysS感受态细胞中，利用氨苄青霉素抗性筛选阳性菌落，并提取质粒进行SmaⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定，将鉴定阳性的质粒命名为pGEX-4T-SRV1。6、一种猴SRV1病毒抗体的免疫梳检测试纸的制备方法，包括如下步骤：（1）以重组表达载体pGEX-4T-SRV1表达猴SRV1病毒蛋白；（2）猴SRV1蛋白的纯化与定量；（3）免疫梳检测试纸的制备：（3.1）将步骤（1）中表达的猴SRV1病毒蛋白以0.1mg/mL的浓度进行线性包被NC膜，将膜晾干；（3.2）用0.05g/mL的BSA封闭液封闭NC膜过夜，弃去封闭液后再次晾干；（3.3）将包被好的NC膜裁剪成标准尺寸的试纸条，依次按一定间距整齐固定于PVC板上，十二条为一组或直接裁剪包被好的NC膜制成免疫梳检测试纸，最终于自封袋中低温保存备用。7、如上所述的一种猴SRV1病毒抗体的免疫梳检测试纸的制备方法制备的一种猴SRV1病毒抗体的免疫梳检测试纸。8、如上所述的一种猴SRV1病毒抗体的免疫梳检测试纸，其检测方法如下：（1）将1:25倍稀释的待检血清样品转移至96孔酶标反应板中，标记顺序号；（2）将免疫梳检测齿依次伸入各反应孔内的血清液面之下，37℃轻轻震荡30-60min；（3）取出免疫梳用TBS-T缓冲液冲洗三次，每次3-5min，同时将稀释好的碱性磷酸酶标记1:500兔抗猴二抗溶液顺次加入另一排酶标反应板孔中，每孔≥300μL，将洗过的免疫梳依次伸入各反应孔中，37℃震荡30-60min；（4）取出免疫梳按上述方法冲洗3次后置于干净的方盒中加入显色液，静止、闭光显色1-15min，最后用蒸馏水冲洗免疫梳并观察记录反应结果；（5）上述操作过程中设立阳性对照与阴性对照各1孔；（6）阳性对照免疫梳齿上有明显的肉眼可见反应条带，蓝紫或黑色，且阴性对照梳齿上无反应条带，说明检测有效，在此基础上进行下一步待测样品的判定；（7）待测样品检测的免疫梳齿上与阳性对照梳齿上相同位置处出现可见反应条带的判定为阳性检测结果，若待测样品检测的免疫梳齿上无反应条带出现则判定为阴性检测结果。9、如上所述的一种猴SRV1病毒抗体的免疫梳检测试纸在检测猴SRV1病毒抗体中的应用。本专利技术提供了一种不需要特定仪器设备辅助的检测试纸，解决了目前进出口实验猴SRV1病毒抗体检测缺乏现场操作简便的试剂盒的现状，能够应用于大规模现地检样的检测。该试纸具有快速、简便、经济、不需任何特殊仪器，保留了常规ELISA的敏感、特异的优点，又克服了许多繁琐的操作，节省了操作时间，缩短了实验周期，完全可在野外进行实地诊断检测，达到快速诊断本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于构建猴SRV1病毒抗体的免疫梳的SOE‑PCR引物组，其特征在于，引物SRV1F：如序列表Seq No.1所示，引物SRV1R：如序列表Seq No.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于构建猴SRV1病毒抗体的免疫梳的SOE-PCR引物组，其特征在于，引物SRV1F：
如序列表SeqNo.1所示，引物SRV1R：如序列表SeqNo.2所示。
2.一种用于制备猴SRV1病毒抗体的免疫梳的重组表达载体pGEX-4T-SRV1，其特征在
于，序列如序列表SeqNo.3所示。
3.一种用于制备猴SRV1病毒抗体的免疫梳的重组表达载体pGEX-4T-SRV1的构建方
法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）根据猴SRV1病毒的基因序列，设计SOE-PCR扩增引物，引物SRV1F：如序列表Seq
No.1所示，引物SRV1R：如序列表SeqNo.2所示；
（2）进行SOE-PCR扩增猴SRV1病毒基因；
（3）猴SRV1病毒基因的回收；
（4）克隆质粒pMD18T-SRV1的构建及测序；
（5）表达载体pGEX-4T-SRV1的构建，序列如序列表SeqNo.3所示。
4.根据权利要求3所述的一种用于制备猴SRV1病毒抗体的免疫梳的重组表达载体
pGEX-4T-SRV1的构建方法，其特征在于，所述的步骤（2）采用SOE-PCR反应的具体步骤如
下：
将混合液在95℃预变性5min，94℃变性1min，63℃退火30s，72℃延伸1min，30
个循环，72℃总延伸10min；
上述混合液如下所示：
。
5.根据权利要求3所述的一种用于制备猴SRV1病毒抗体的免疫梳的重组表达载体
pGEX-4T-SRV1的构建方法，其特征在于，所述的步骤（5）pGEX-4T-SRV1的构建方法具体步骤
如下：利用EcoRⅠ与XhoⅠ分别将pMD18T-SRV1和pGEX-4T-1进行双酶切，并胶回收酶切的目的
片段，将回收的目的片段进行连接，将连接产物转化到BL21（DE3）pLysS感受态细胞中，利用
氨苄青霉素抗性筛选阳性菌落，并提取质粒进行SmaⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定，将鉴定阳性的质
粒命名为pGEX-4T-SRV1。
6.一种猴SRV1病毒抗体的免疫梳检测试纸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
...

【专利技术属性】
技术研发人员：李丹丹，高慎阳，徐义刚，邱索平，
申请(专利权)人：海南出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：海南;46